半胱氨酸（Cysteine,Cys）是二十种天然氨基酸中唯一含有还原性巯基的氨基酸,是细胞中硫代谢的中心物质。在动物细胞中,Cys参与了肽链的合成和折叠、氧化还原平衡调控、细胞信号传导、解毒、凋亡等大量生命过程,在生命系统中有着不可或缺的重要地位。其在肌体内的浓度异常与心脑血管疾病、神经退行性疾病、癌症等重大疾病的发病密切相关。本文以pH调控的巯基亲核加成反应活性为思路,对三种生物硫醇Cys、同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）和谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的亲核反应活性进行了细致研究,成功利用pH的调控作用,发展了系列Cys特异性荧光探针,并将这些荧光探针用于细胞质以及细胞器中Cys的特异性标记检测,实现了对细胞内Cys有氧代谢产生SO₂过程的可视化荧光成像。基于pH调控的巯基与α,β-不饱和酮亲核加成反应构建的荧光探针能够实现对Cys的特异性可逆识别检测,具有更高的成像应用价值。具体研究工作如下:1.设计合成了两个色烯衍生物2-1-CH₃和2-1-Br用于硫醇识别检测。其中,2-1-CH₃对Cys具有较好的选择性,并表现为Turn-On型荧光响应。检测体系pH的增大能够明显地促进2-1-CH₃与Cys的响应速率。结合其响应机理研究,我们确认,在巯基与α,β-不饱和酮的亲核加成反应过程中,测定体系的pH能够调控巯基的亲核加成反应活性。2.利用前述所得的pH对巯基亲核加成反应活性的调控作用,进一步设计合成了基于丙烯酰基为反应位点的香豆素衍生物3-1。3-1与生物硫醇的荧光响应受到测试体系pH的调控,即在pH 7.4环境中,3-1能够特异地对Cys进行识别检测;在pH 7.8环境中,3-1能够通过双通道荧光发射对Cys和Hcy进行区分识别检测。以上过程成功在细胞水平得到验证。其调控机制为pH诱导的巯基—α,β-不饱和羰基的亲核加成反应和分子内氨基—酯基的亲核取代反应。此实验结果表明,Cys中巯基和氨基的亲核反应活性均受到pH的调控,即pH值增大能够加强巯基和氨基的亲核反应活性。3.利用pH在探针对硫醇的特异性反应中的调控作用,设计合成了香豆素衍生物4-1用于细胞溶酶体中Cys的特异性可逆识别检测。利用实时细胞成像实验,我们证明了4-1对溶酶体中Cys的原位检测过程。此外,在地塞米松诱导的细胞凋亡过程中,溶酶体内Cys的浓度未发生明显变化。4.针对细胞内Cys的有氧代谢途径设计合成了香豆素衍生物5-1。Cys在细胞内经半胱氨酸双氧化酶和天冬氨酸氨基转移酶催化能够生成气体信号分子二氧化硫。为了实现对该代谢过程的实时监测,我们在探针中分别引入Cys反应位点和SO₂反应位点,探针与Cys和SO₂反应表现出不同波长的荧光发射信号(λ_{em Cys}=514 nm;λ_{em SO2}=576 nm),且Cys反应位点与Cys的反应快速、可逆。由此,我们通过对514 nm和576 nm处的荧光发射强度的监测实现了该代谢过程的可视化荧光成像。