【研究背景与目的】胚胎干细胞（ESC）是分离自囊胚内细胞团的一种多能干细胞。对于多能性的定义可以从其分化能力进行分类，处于最顶端的是诸如受精卵等能够分化为一个单独个体的能力，我们常称这种细胞为全能性干细胞；其次，具有能够分化为多种组织细胞能力的干细胞我们称之为多能性干细胞，而这其中ESC具有分化为任意组织细胞的能力，是所有多能性干细胞中“干性”最强的一种干细胞；而具有分化为特定组织的干细胞则常称之为前体或祖细胞。我们所研究的人ESC作为一种在多能性上仅次于全能干细胞的细胞，其能够在不丧失自身多能性的同时在体外环境下无限扩增，以及在特定诱导下形成各种组织细胞的特性使其成为用于生物发育研究、药物筛选、组织修复的最理想细胞来源。然而目前对于胚胎干细胞的多能性是通过何种机制维持的，以及基于何种机制调控其分化为各个组织细胞的具体机理尚不明确，致使其应用受到一定程度的局限。ESC的多能性是受到严格调控的。早期研究的内容主要集中在信号通路对hESC的作用上，从中发现了Nodal/Activin以及BMP等信号通路对自我更新及多能性的影响。在对多种干性维持信号通路下进行深入探索后，发现下游的近乎所有多能性相关基因都受到转录因子Oct4，Sox2和Nanog的调控，因此人们将这三个因子称之为多能性核心转录因子。而在山中伸弥（Shinya Yamanaka）通过将四个多能性转录因子导入成体细胞并使之成功转变为ESC样的细胞后，更是引发了人们对于研究ESC干性调控网络的浓厚兴趣。其中非编码RNA的相关研究在近几年来得到相当大的重视。非编码RNA（ncRNA）曾被认为是细胞内多余的成分，是RNA聚合酶II的副产物，并没有什么实际的功能。而随着技术水平的革新，目前已经鉴定出不少具有特殊功能的非编码RNA。对于小于200bp的RNA来说小RNA（miRNA）的功能是被研究最多的，而目前在hESC中对于大于200bp的长链非编码RNA（lncRNA）的相关研究仍属于起步阶段，其中较为具有代表性的便是我科之前所完成的关于LincRNA-ROR的作用机制研究。对于长链非编码RNA（lncRNA）来说，目前不少文献报道了长链非编码的作用机制，如参与基因组表观遗传学印记以及染色质组蛋白修饰，转录起始的活性调控，转录后水平RNA的调控，蛋白功能调节等多种重要的信号转导调控过程，可以说是一片未被挖掘过的宝藏，值得我们进一步探究发现新的lncRNA的新作用机制，以更进一步地理解ESC的多能性调控。以往对于ncRNA的功能研究常只集中在一条ncRNA的某一个靶上。而随着技术理念的不断革新，发现了许多ncRNA相互之间互相调控的实例，其中内源性竞争性RNA（ceRNA）理念的提出与发现为细胞内基因表达转录后调控网络增添了一个新的层面。以往对于miRNA的研究只集中在其一个靶上，但不断有人证明发现单一miRNA的靶可以对应成千上万个mRNA或lncRNA，而一条RNA也可能同时受到多条miRNA的调控。以此为依据所能构建起的是一个miRNA与mRNA及lncRNA相互作用的网络，而影响其网络中的任一成分均会对该网络的平衡造成很大影响，出现表型的变化。ESC的干性调控网络也同样存在这种机制。在之前的研究中我们发现lincROR具有竞争内源mir-145的作用来提高ESC的多能性。而本课题的主要内容就是进一步研究挖掘ESC干性调控网络中的重要组成成分。首先从发掘新的影响ESC干性调控的miRNA入手，通过生物信息学高通量筛选以核心转录因子Oct4，Nanog，Sox2为靶标中心的miRNA并验证其功能。然后对ESC中具有高丰度，干性丧失后迅速下调的lncRNA进行筛选与功能鉴定，找到了一条与ESC多能性维持与自我更新密切相关的lncRNA-GAS5。最后，我们发现了GAS5影响ESC自我更新的方式主要是通过其转录后吸附大量促分化miRNA进行的。至此构建出一个以lncRNA-GAS5竞争促分化miRNA调控hESCs多能性的内源miRNA竞争性调控网络。第一部分：多能性因子靶向性小RNA对hESC的影响研究方法：（1）通过检索NCBI GEOdatabase找到与hESC分化前后miRNA表达芯片数据（GSE14473），通过芯片分析软件高通量筛查分化中明显上调的miRNA。（2）利用miRNA靶位点预测软件miRanda预测66个候选miRNA与多能性因子Oct4，Nanog，Sox2的结合，从中找出miRNA进行后续研究。（3）利用双荧光素酶报告系统及过表达miRNA模拟体实验验证候选miRNA的功能。（4）通过构建hESC的分化模型，研究mir-149及mir-320在分化后的表达变化，同时通过AP染色、免疫荧光检测SSEA4实验研究其对hESC多能性的影响。（5）利用mir-149及mir-320的模拟体及抑制剂研究其表达变化多hESC的分化趋势的影响。结果：（1）通过芯片分析软件对芯片数据进行处理，同时利用聚类分析筛查出66条在8种不同hESC细胞系以及1种畸胎瘤细胞系中随分化而发生明显上调的miRNA。（2）构建66条miRNA的fasta数据库，利用miRanda靶位点预测软件的高通量预测能力筛查与多能性因子Oct4，Nanog，Sox2的结合，发现其中6条具有较强相关性，作为候选研究对象。（3）双荧光素酶报告基因实验及过表达实验均显示mir-149及mir-320能够有效抑制Oct4的mRNA及蛋白表达水平。（4）通过real-time检测我们发现mir-149及mir-320的表达随分化程度不断升高，与Oct4及其它多能性因子的变化呈负相关，进一步提示其对hESC的促分化作用。（5）在过表达mir-149及mir-320后我们发现神经外胚层的相关marker均发生明显的上调，而对比Oct4干扰的结果我们发现mir-149及mir-320的促神经外胚层分化作用不仅是通过下调Oct4引起的，利用生物信息学预测及实验筛选，我们发现了另一个分化关键基因，β-catenin，受到mir-149及mir-320的调控。结论：我们通过高通量的手段筛查既有芯片数据，对芯片数据进行深入挖掘，同时辅以生物信息学预测手段，最终通过一系列实验研究找到并验证了两条未在hESC中报道的小RNA mir-149及mir-320具有靶向多能性因子Oct4，并促进hESC分化的作用。此外，在对mir-149及mir-320在分化中的功能进行深入研究后发现，mir-149及mir-320能够特异地抑制分化后β-catenin的表达，促进hESC向神经方向分化，进一步揭示了miRNA在hESC中作用的重要性。第二部分：LncRNA-GAS5在hESC中对多能性的影响研究方法：（1）通过高通量测序技术检测hESC中分化前后差异表达的lncRNA。（2）构建部分筛选出的lncRNA过表达载体，并于hESC中进行过表达，通过real-time PCR检测其对多能性基因的影响。（3）构建稳定转染GAS5过表达及干扰的hESC细胞株，并对该细胞株进行表型变化的鉴定。（4）对发现表型变化的GAS5进行深入研究，通过cck8，流式细胞周期，AP染色检测hESC的多能性在GAS5过表达及干扰下的变化。（5）通过原位杂交、核质分离技术研究GAS5在hESC分化前后的细胞定位。结果：（1）通过对高通量RNA-seq数据进行分析，挑选出分化前后具有较大变化的lncRNA。（2）构建DANCR、LOC100506647、LINC00458、GAS5的过表达载体，并于hESC中进行过表达，通过real-time PCR检测发现GAS5能够显著上调多能性基因Oct4，Nanog与Sox2。（3）转染GAS5过表达慢病毒及干扰慢病毒，通过荧光显微镜观察每代标签蛋白GFP的变化，同时通过筛选标记Puro进行筛选。鉴定出稳定的hESC细胞株用于后续实验。同时通过观察研究稳转细胞株的表型特点发现过表达GAS5的hESCs增殖较快，细胞克隆密集；而干扰的细胞株则呈现出相反的状态。（4）CCK-8、流式细胞周期检测显示在过表达GAS5后hESC的增殖明显加快，同时S期的细胞明显增多。AP染色显示过表达GAS5后hESC克隆明显增多，多能性增强，干扰后克隆数明显减少。（5）原位杂交及核质分离实验结果显示GAS5主要聚集于胞质中，随hESC的分化胞质GAS5的量发生明显下调且与多能性成正相关。结论：通过高通量RNA-seq的优势，准确找出了在hESC分化前后产生明显差异的lncRNA。通过挑选个别表达丰度较高的lncRNA进行功能鉴定，成功地发现了GAS5具有促进hESC自我更新及多能性的作用。而对其亚细胞水平定位的分析则揭示了GAS5胞质中的水平与多能性因子的关系，为后续机制实验打下基础。第三部分：GAS5通过竞争内源性小RNA促进hESC的多能性方法：（1）通过高通量测序研究与GAS5共表达的基因，对共表达基因进行进一步的生物信息学分析，找出与GAS5作用相关的因子或信号通路。（2）通过RNA-IP技术检测GAS5过表达或干扰情况下NODAL的mRNA上AGO-2蛋白的结合变化。干扰Dicer酶研究GAS5的表达变化对hESC自我更新的作用。（3）利用高通量测序技术筛选与GAS5及NODAL结合的miRNA并通过双荧光素酶报告基因实验验证。过表达预测的候选miRNA，研究其对GAS5、NODAL以及hESC多能性的变化。（4）研究GAS5的上游，通过过表达多能性因子找到启动GAS5高表达的原因，通过chIP，EMSA等实验进行验证，构建完整的GAS5对hESCs多能性作用的机制网络图。结果：（1）对测序结果进行聚类分析发现共表达基因中有与多能性维持相关的信号通路关键基因如NODAL、TGFB3，还有与增殖相关的基因CDK4。对该部分基因进行GO功能分析发现与SMAD通路的激活具有高度相关性，对信号通路进行蛋白水平检测分析则显示NODAL-TGFbeta-SMAD2/3该通路在GAS5过表达下受到激活起到多能性维持的重要作用。（2）干扰Dicer酶后miRNA总量发生明显下调，在此情况下过表达或干扰GAS5对多能性因子Oct4，NANOG与Sox2的促进作用相对弱于未干扰Dicer组。RNA-IP结果显示GAS5过表达后NODAL的mRNA上AGO-2蛋白的结合明显降低，干扰后明显升高，提示GAS5能够竞争结合于NODAL上的AGO-2-miRNA复合体。（3）通过高通量测序技术筛选出与GAS5及NODAL高度相关的miRNA共56条，设立评分系统，挑选评分最高的10条miRNA进行双荧光素酶实验验证靶向性。通过双荧光素酶报告基因的实验验证了其作用。（4）研究GAS5的上游会否被OCT4以及SOX2结合启动，行chIP及过表达多能性因子等相关实验进行分析和验证。结论：实验结果显示GAS5的促多能性促自我更新作用与NODAL的变化明显相关，并且其影响NODAL的作用与miRNA的变化亦密切相关，此外hESC多能性的上调在miRNA总量下调后变化不明显，提示GAS5有可能通过抑制NODAL靶向性miRNA从而上调hESC整体多能性水平，促进hESC的多能性及自我更新。通过miRNA-seq与生物信息学技术的结合，我们找到并验证出了GAS5及NODAL之间共享的抑制性miRNA。随后我们通过生物信息学分析偶然发现GAS5能够被Oct4与Sox2结合并启动转录，形成一条hESCs中的前馈性回路。最后我们的实验结果表明GAS5能够通过竞争抑制这些共享的抑制性miRNA提高NODAL的表达水平促进多能性因子的表达，而多能性因子中Oct4与Sox2亦能够反过来启动GAS5转录，形成一条前馈性回路，从而促进hESC的自我更新及多能性。小结本研究通过高通量筛选，发现了mir-149、mir-320在hESC中随分化程度增加而发生明显上调，同时在未分化时其过表达能够影响hESC的自我更新及多能性。通过生物信息学预测以及功能实验验证了其靶向Nanog、Oct4mRNA的作用，同时在对其促分化作用进行深入研究时发现mir-149及mir-320在神经分化方向上的重要作用。本研究成功筛选并验证了lncRNA-GAS5能够影响hESC的自我更新及多能性。尽管GAS5曾被多次报道在不同肿瘤及正常组织中抑制细胞的增殖，并与GR的功能抑制有关，但在ESC中我们验证并发现了其促自我更新的能力与其在胞质中的大量聚集有关，而与GR的抑制无关。通过高通量测序技术辅以功能验证我们发现GAS5能够通过竞争部分miRNA促进多能性因子的表达，从而促进表型的变化。本研究首次提出并证实了GAS5能够通过竞争多能性因子靶向性miRNA，提高多能性维持关键通路中NODAL的表达水平，从而影响多能性基因，并最终影响hESC多能性这一调控机制，为深入理解hESC多能性调控网络以及内源竞争性机制作出重要贡献。