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目的:1.建立同时检测生物检材中瑞芬太尼及其代谢物瑞芬太尼酸的高效液相色谱串联质谱检测方法。2.研究瑞芬太尼和瑞芬太尼酸在大鼠体内的毒物代谢动力学,获得毒物代谢动力学方程和参数;探究瑞芬太尼的浓度、瑞芬太尼酸的浓度和瑞芬太尼酸/瑞芬太尼浓度比与吸毒时间的关系,推断吸毒时间方程。3.研究瑞芬太尼和瑞芬太尼酸在大鼠体内的死后分布,为静脉注射瑞芬太尼中毒和致死案件中检材的提取提供实验依据。方法:1.检测方法:生物检材中添加50%柠檬酸,混匀后,加入内标瑞芬太尼-13C6,然后用乙腈沉淀蛋白,采用高效液相色谱串联质谱仪进行检测,用保留时间和离子对的相对丰度比进行定性,用内标法进行定量。2.动物模型:2.1毒物代谢动力学模型:选用体重为220±20g健康SD雄性大鼠10只,适应性喂养9天,于实验前一天禁止进食。将大鼠随机分为两组:1/4LD50组（5只）、1/2LD50组（5只）,于尾静脉注射给药后1min、3min、5min、10min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、7h、8h、9h、11h眼静脉取血800μL,取出200μL留作血液样本,剩余血液制成血浆样本,于-80℃保存待检。2.2死后分布模型:选用体重为220±20g健康SD雄性大鼠12只,适应性喂养9天,于实验前一天禁止进食。将大鼠随机分为两组:2LD50组（6只）、LD50组（6只）,尾静脉注射给药,待呼吸、心跳等生命体征消失后（在给药10min后生命体征未消失的大鼠,于10min脱颈处死）,迅速进行解剖,立即取心、肝、胃壁、外周血、脾、肺、右下肢肌肉、肾、大脑、心血、睾丸,于-80℃密封保存。3.数据处理:通过DAS3.2.8药代动力学软件获得瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的毒物代谢动力学方程和参数;通过回归分析对瑞芬太尼的浓度、瑞芬太尼酸的浓度及瑞芬太尼酸/瑞芬太尼浓度比与吸毒时间的关系进行拟合,获得吸毒时间推断方程。运用MATLAB R2016b软件进行吸毒时间推断;使用Graphpad Prism8.0.2进行统计学分析和作图。结果:1.瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的检测方法:在血液中,瑞芬太尼的线性范围为0.01～200ng/m L,决定系数（R~2）大于0.995,最低检出限（LOD）是0.005ng/m L,最低定量限（LOQ）是0.01ng/m L;瑞芬太尼酸的线性范围为0.01～200.00ng/m L,R~2大于0.995,LOD是0.002ng/m L,LOQ是0.01ng/m L。在血浆中,瑞芬太尼的线性范围是0.01～200.00ng/m L,R~2大于0.995,LOD是0.002ng/m L,LOQ是0.01ng/m L;瑞芬太尼酸的线性范围是0.5～200.00ng/m L,R~2大于0.995,LOD是0.001ng/m L,LOQ是0.006ng/m L。在肝脏中,瑞芬太尼的线性范围为0.5～200ng/m L,R~2大于0.995,LOD是0.01ng/m L,LOQ是0.03ng/m L;瑞芬太尼酸的线性范围为0.05～200ng/m L,R~2大于0.995,LOD是0.01ng/m L,LOQ是0.02ng/m L。日内精密度和日间精密度均小于19.2%,准确度处于87%～119%之间。瑞芬太尼的相对提取回收率均大于103.6;瑞芬太尼酸均大于70.5%。瑞芬太尼的基质效应处于85.7～103%之间;瑞芬太尼酸处于61～137%之间。经前处理后的样品在室温下存放24h、48h后,瑞芬太尼和瑞芬太尼酸均比较稳定。2.瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的毒物代谢动力学:不同剂量瑞芬太尼经大鼠尾静脉注射给药后,瑞芬太尼和瑞芬太尼酸均可在血液、血浆中检出。在血液、血浆中,低剂量组瑞芬太尼在4h内可以检出,高剂量组瑞芬太尼在9h内可以检出;而瑞芬太尼酸的检出时限较长,不同剂量组瑞芬太尼酸在11h内均可以检出。在血液中,低剂量组瑞芬太尼符合一级吸收二室开放模型,拟合方程为C=107.16*e-18.13*t+18.29*e-1.22*t;瑞芬太尼酸符合一级吸收三室开放模型,拟合方程为C=1166.76*e-1.54*t+5752.89*e-3.98*t+96.32*e-0.36*t。高剂量组瑞芬太尼符合一级吸收三室开放模型,拟合方程为C=50.91*e-1.64*t+59.88*e-1.1*t+10.32*e-0.78*t;瑞芬太尼酸符合一级吸收一室开放模型,拟合方程为C=7443.42*e-0.84*t。在血浆中,低剂量组瑞芬太尼符合一级吸收三室开放模型,拟合方程为C=93.4*e-17*t+19.75*e-1.35*t+3.18*e-0.89*t;瑞芬太尼酸符合一级吸收三室开放模型,拟合方程为C=2861.12*e-7.18*t+6186.06*e-1.12*t+1140.84*e-0.58*t。高剂量组瑞芬太尼符合一级吸收两室开放模型,拟合方程为C=102.42*e-3.26*t+15.58*e-0.32*t;瑞芬太尼酸符合一级吸收一室开放模型,拟合方程为C=13531.61*e-0.69*t。3.瑞芬太尼吸毒时间的推断:本研究比较了瑞芬太尼的浓度、瑞芬太尼酸的浓度及瑞芬太尼酸/瑞芬太尼浓度比等三种方法推断吸毒时间的准确度,发现低、高剂量两组血液、血浆中瑞芬太尼及其代谢物的浓度随时间的变化趋势可以用乘幂、对数、指数等多种形式得到决定系数均大于0.86的拟合曲线;瑞芬太尼/瑞芬太尼酸浓度比随时间的变化趋势可以用多项式的形式得到决定系数均大于0.96的拟合曲线。4.瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的死后分布:瑞芬太尼的分布:瑞芬太尼在LD50组大鼠体液和脏器中的含量分布依次为:胃壁＞心血＞外周血＞肾＞肺＞心＞肝＞大脑＞脾＞右下肢肌肉＞睾丸,经统计学分析,胃壁、心血、外周血、肾、肺、心、肝、大脑＞脾、右下肢肌肉、睾丸,P＜0.05,具有统计学意义。瑞芬太尼在2LD50组大鼠体液和脏器中的含量分布依次为:胃壁＞心血＞外周血＞肺＞肾＞心＞肝＞大脑＞右下肢肌肉＞脾＞睾丸,经统计学分析,胃壁、心血＞外周血、肺、肾、心、肝、大脑、右下肢肌肉、脾、睾丸,P＜0.05,具有统计学意义。瑞芬太尼酸的分布:瑞芬太尼酸在LD50组大鼠体液和脏器中的含量分布依次为:胃壁＞肾＞肺＞肝＞心＞外周血＞大脑＞心血＞脾＞右下肢肌肉＞睾丸,经统计学分析,胃壁、肾、肺＞肝、心、外周血、大脑＞心血、脾、右下肢肌肉、睾丸,P＜0.05,具有统计学意义。瑞芬太尼酸在2LD50组大鼠体液和脏器中的含量分布依次为:肺＞肾＞肝＞胃壁＞心＞外周血＞大脑＞心血＞脾＞右下肢肌肉＞睾丸,经统计学分析,肺、肾、肝、胃壁、心＞外周血、大脑、心血＞脾、右下肢肌肉、睾丸,P＜0.05,具有统计学意义。结论:1.本研究建立检测生物检材中瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的高效液相色谱串联质谱检测方法,样本用量少、前处理简单、相对回收率高、稳定性好、灵敏度高,可以用于瑞芬太尼相关案件中瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的检测。2.本研究建立了瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的毒物代谢动力学模型,得到了瑞芬太尼和瑞芬太尼酸的毒物代谢动力学方程及参数。发现不同剂量瑞芬太尼经大鼠尾静脉注射给药后,瑞芬太尼和瑞芬太尼酸均可在血液、血浆中检出,且瑞芬太尼酸的检出时限比瑞芬太尼长。瑞芬太尼的毒物代谢动力学过程可用一级吸收二、三室开放模型描述,代谢物瑞芬太尼酸的毒物代谢动力学过程可用一级吸收一、三室开放模型描述,可以为瑞芬太尼中毒案件提供毒物代谢动力学依据。3.本研究比较了瑞芬太尼的浓度、瑞芬太尼酸的浓度及瑞芬太尼酸/瑞芬太尼浓度比等三种方法推断吸毒时间的准确性,发现瑞芬太尼酸/瑞芬太尼浓度比与吸毒时间拟合的方程推断吸毒时间的准确度更高。因此,可以把瑞芬太尼酸/瑞芬太尼浓度比代入多项式方程中推断吸毒时间,为瑞芬太尼吸毒案件提供吸毒时间推断的依据。4.本研究建立了不同剂量瑞芬太尼经大鼠尾静脉注射给药的死后分布模型。瑞芬太尼在大鼠体液和各脏器中分布不均,但死后分布规律与剂量无关;瑞芬太尼酸在大鼠体液和各脏器中分布不均,且死后分布规律与剂量有关。提示在瑞芬太尼中毒和致死的相关案件中除收集心血、外周血外,还可以提取胃壁、肾、肺作为主要生物检材进行毒物分析。由于瑞芬太尼代谢的独特性,要求瑞芬太尼相关案件发生时要即刻提取检材,检材因低温冷冻保存,及时送检。