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锌指蛋白广泛存在于真核及原核生物中,作为转录调控因子,通过选择性的与特异靶结构结合,在基因表达调控、细胞分化、配子功能、胚胎发育等生命活动中发挥着重要的作用。牛锌指蛋白33B(ZNF33B)基因全长35440bp,c DNA全长1358bp,编码一个由137氨基酸组成的蛋白。因其含有krüppel相关性保守盒的C2H2型锌指蛋白,也称KRAB型锌指蛋白。ZNF33B基因广泛存在于各个器官组织中,目前对ZNF33B基因功能的研究较少,尤其在卵巢中,仅有少量文献表明ZNF33B基因的表达量在实施超数排卵的卵巢内卵丘细胞中有显著改变,但其具体表达规律、对卵巢组织与卵母细胞成熟的作用及功能尚不明确。本研究首先发现牛ZNF33B基因5’UTR存在g.-61G>T突变,等位基因G、T的基因频率分别为0.3489和0.6511,三种基因型AA、AB、BB频率分别为0.1007、0.4964和0.4029。经统计学分析发现,BB型个体在超排后总卵数、可用胚胎数、退化胚胎数及未受精卵数都显著或极显著高于AA型个体(P<0.05或P<0.01),AB型个体超排性状位于前两者之间。同时,在ZNF33B第一内含子也存在一段124bp的插入序列,在所测群体中的插入率为12.95%,但存在该段插入序列的牛个体在所分析的超排性状上与未插入组比较并无显著差异(P>0.05)。基于上述研究结果,为明确ZNF33B基因在卵巢组织中的表达规律,本研究首先通过QRT-PCR、Western Blot、免疫组化及免疫荧光等方法,对ZNF33B在牛卵巢中的表达情况进行了进一步研究。结果显示,ZNF33B在卵泡期卵巢皮质及髓质中的表达量高于黄体期卵巢皮质;而在不同发育时期黄体中,ZNF33B的表达由血体期-分泌黄体期-白体期呈逐渐下降趋势;ZNF33B主要分布于各级卵泡内卵母细胞的胞质及颗粒黄体细胞胞质内,在卵巢基质、卵丘细胞胞质、膜黄体细胞胞质均有分布,但表达量低于卵母细胞及颗粒黄体细胞胞质。而卵母细胞在通过体外培养成熟后分别进行孤雌激活和体外受精形成的早期胚胎中,ZNF33B主要分布于早期胚胎各卵裂球的细胞核中。基于ZNF33B基因在卵巢组织内具有差异表达且对卵母细胞成熟具有潜在作用的可能,本研究进一步对其在卵丘细胞生长发育及卵母细胞成熟中的作用进行了深入研究。本研究首先通过QRT-PCR发现卵母细胞成熟后卵丘及卵母细胞的ZNF33B的表达极显著升高(P<0.01),然后通过RNAi技术敲减ZNF33B基因在原代培养的卵丘细胞中的表达,卵丘细胞经流式细胞术分析显示低表达ZNF33B基因的卵丘细胞早期凋亡率显著高于对照组(P<0.05),晚期凋亡率和细胞凋亡总率极显著高于对照组(P<0.01),表明低表达的ZNF33B促进卵丘细胞的凋亡。随后,为进一步探讨ZNF33B在卵母细胞成熟过程中的作用和具体机制,本研究采用显微注射方法先将si RNA注入GV期卵母细胞胞质中,进行体外培养和成熟,通过观察第一极体排出情况及相关功能基因的表达明确ZNF33B对卵母细胞成熟的影响。结果显示注射组卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01);而对卵母细胞成熟具有重要作用的Cdc25C、PDE3A、CCNB1和RBBP4表达水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),而EGFR和RBL2表达无显著变化(P>0.05)。综上所述,ZNF33B基因多态性对牛超数排卵性状具有重要影响,可作为牛超数排卵性状分子标记并应用于早期选种、选育。ZNF33B在卵巢组织中的表达具有时空特异性,可影响卵丘细胞生长发育并可调控特定细胞因子的表达影响卵母细胞成熟,本研究从基因水平及蛋白水平明确了ZNF33B基因影响卵母细胞成熟的作用,不仅为深入解析锌指蛋白分子调控通路及其作用以及卵母细胞成熟的机制提供了理论基础,还为提高雌性动物繁殖力及早期选种选育提供了新依据。