随着全球人口老龄化的加剧,中枢神经系统疾病(帕金森症、阿尔茨海默症、脑肿瘤等)的发病率逐年上升,已经成为威胁人类健康的主要疾病之一。尽管经过了几十年的深入研究,治疗中枢神经系统疾病的最大难题仍然是大分子药物如何有效地通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)。血脑屏障主要由脑毛细血管内皮细胞及细胞间的紧密连接构成,几乎98%的小分子药物和全部大分子药物难以通过,从而严重限制了治疗中枢神经系统疾病药物的作用。近年来受体介导的脑内靶向递药系统为大分子药物治疗中枢神经系统疾病带来了希望,其中,转铁蛋白受体(Transferrin receptor,TfR)由于可以介导内源性大分子转铁蛋白(Transferrin,Tf)跨越血脑屏障转运,同时具备很强的外源分子载运功能,因而一直是研究大分子药物通过血脑屏障运送的热门靶标。研究表明,利用大鼠Tf R的单克隆抗体OX26,可将偶联的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)递送入脑。然而目前报导的用于转运的TfR抗体多为鼠源或人源化的嵌合抗体,应用于人体时不可避免地会产生一些不良反应。因此,探寻活性更好、免疫原性更低的TfR人源抗体无疑更具优势,并具有重要的应用价值。本实验室近年建立了基于哺乳动物细胞的表面展示型人源单链抗体库,因其使用真核细胞进行抗体分子展示,具有原核表达体系所不具备的翻译后修饰功能,所以获得的抗体分子更接近天然人源抗体,免疫原性更低。在本课题中,我们以人TfR为靶蛋白,对哺乳动物细胞表面展示型人源单链抗体(single-chain antibody fragment variable,ScFv)库进行筛选,初步获得能够与TfR结合的ScFvs,进一步利用获得的ScFvs构建分泌型抗体库,利用高表达TfR的细胞进行功能性筛选,最后对筛选到的抗TfR抗体进行重组表达及初步活性分析。本论文第一部分为哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库的筛选。首先提取展示型人源ScFv抗体质粒库,然后将抗体质粒库瞬时转染293T细胞,培养约60 h后,单链抗体分子将在细胞膜表面进行表达。将FITC标记的人TfR与细胞混合,室温条件下孵育1 h(TfR的终浓度为10nM)。反应结束后,通过流式细胞仪进行分选,按照荧光强度收集约占总细胞数0.3%的阳性细胞。从分选管中回收阳性细胞,提取质粒并扩增,作为第二轮流式分选的抗体质粒库。在第二轮筛选时,将TfR的终浓度降低至1nM,其余操作同第一轮筛选时一样,按荧光强度收集细胞总数0.2%的阳性细胞。通过降低TfR浓度的策略,筛选出的抗体亲和力进一步提高,将候选分子的范围缩小,以利于后续的功能性筛选。第二轮流式分选后,对阳性克隆进行序列分析,并利用igblast数据库对所得序列进行鉴定分析,结果显示,所得序列均为功能性人免疫球蛋白可变区基因,说明从展示型全人源scfv抗体库中筛选到的序列,可以作为进一步功能性筛选的基础文库。本论文第二部分为哺乳动物细胞分泌型人源scfv抗体库的构建与筛选。首先对第二轮流式分选后的阳性细胞提取质粒并扩增,以其作为模板,根据哺乳动物细胞展示型人源scfv抗体库构建时所用的简并引物,设计含有bspqⅠ酶切位点的28对通用引物,对初筛获得的单链抗体基因进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)扩增。回收pcr扩增产物,以限制性内切酶bspqi分别对pcr产物和sgls载体进行酶切消化,将酶切后的scfv片段插入哺乳动物细胞分泌型表达载体sgls中,使scfv融合于载体上的lc片段上游,构建分泌型抗体质粒库。载体上所带有的lc片段,一方面可作为纯化标签帮助纯化,同时有助于提高表达水平,并且在功能研究时,可作为scfv携带药物的替代物,便于考察scfv能否携带lc通过bbb。将构建好的分泌型人源scfv抗体质粒库,通过电穿孔转染cho-k1细胞,转染后细胞分装于96孔培养板内培养21d。以抗人igg多抗包被,elisa分析细胞培养上清,筛选出高表达细胞株。同时,使用penter-tfr质粒瞬时转染293t细胞,培养60h,获得可以在细胞膜表面高表达tfr的筛选用细胞,对候选细胞株培养上清进行流式分析,筛选出表达上清能够与tfr有效结合的4株阳性细胞。提取细胞基因组dna,pcr扩增scfv基因后连入t载体进行测序分析,结果表明,获得了两个不同的抗tfr单链抗体基因序列。进一步通过igblast序列分析,结果显示两条序列均为全新的功能性人免疫球蛋白可变区基因。本论文第三部分为人源抗tfr-scfv-lc融合蛋白的表达及活性鉴定。分别将阳性细胞株2f8与阳性细胞株5d9接种至cd-cho培养基中,培养7d后,收取上清经0.45μm滤膜过滤,以captol亲和层析柱对蛋白进行纯化。纯化后的蛋白以bca蛋白定量试剂盒测定浓度,2f8号融合蛋白的浓度为0.6mg/ml,5d9号融合蛋白的浓度为0.8mg/ml。将纯化后收集的两个蛋白通过sds-page进行鉴定,结果显示均在38kda附近出现目的条带,与预期大小相符。以westernblot对蛋白进行鉴定,结果表明这两个融合蛋白均可与hrp标记的山羊抗人igg特异性结合。将bca蛋白定量后的两个目标蛋白通过fortebiooctet进行亲和力检测,结果显示2f8融合蛋白与人tfr的亲和常数为3.18×10-7mol/l,5d9融合蛋白与人tfr的亲和常数为7.90×10-7mol/l,2f8融合蛋白的亲和力略优于5d9融合蛋白。将fitc标记的两个融合蛋白分别与天然表达tfr的hcmec/d3细胞共孵育,进行流式细胞术分析,结果显示二者均可与hCMEC/D3细胞结合,且2F8融合蛋白的结合更强,这与之前融合蛋白亲和常数测定结果相吻合。进一步地,将FITC标记的融合蛋白与hCMEC/D3细胞共孵育后,置于激光共聚焦显微镜下观测,结果显示两个融合蛋白均可与hCMEC/D3细胞表面的TfR结合,并通过TfR介导的内吞作用进入hCMEC/D3细胞,说明筛选到的ScFv分子具有携带大分子通过血脑屏障的潜力。综上所述,我们在哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库的基础上,成功构建了人源分泌型ScFv-LC抗体库,并通过筛选获得了两个与TfR具有较好亲和力的全新ScFv,说明这种筛选模式是有效的,为同类分子的筛选提供了方法。纯化获得的两个融合蛋白均可与hCMEC/D3细胞结合并通过TfR介导进入胞内,为后续体内跨血脑屏障运送的研究奠定了基础。