piggyBac转座子是典型的DNA转座子,最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的细胞系中分离出来的。由于该转座子在多种昆虫的基因组上都具有高转座活性,因此piggyBac已经成为一种高效的转基因载体广泛用于昆虫的转基因研究和实践。现在普遍认为,在转座子介导的转基因昆虫中,內源性同源转座子将影响昆虫转基因的成功率和稳定性。因此有必要对目标昆虫进行內源性转座子的调查分析。由于转座子很难用常规的RT-PCR和RACE技术进行克隆鉴定,故本研究在兼并引物PCR的基础上,利用inverse PCR和vectorret PCR技术,不仅调查了鳞翅目两种重要的农业害虫甜菜夜蛾和棉铃虫的內源piggyBac存在情况,同时克隆到了內源性的piggyBac转座子,并且从棉铃虫中获得了一个结构完整、具有潜在活性的piggyBac转座子HaPLE1。1甜菜夜蛾piggyBac转座子基因的克隆与序列分析采用PCR技术,利用兼并引物,从甜菜夜蛾基因组中克隆出一个內源性piggyBac类似因子的DNA片段,并命名为SePLE。该基因片段长456bp,推导的氨基酸序列与几种昆虫中的piggyBac氨基酸序列的相似性达50%-78%,但中间出现1个终止密码子。根据这个片段,通过inverse PCR技术,虽然克隆到两个不同的基因拷贝(SePLE1和SePLE2),但两个拷贝不仅都缺失了特征性的短末端重复序列,而且编码转座酶的开放阅读框中也都出现了多个突变(终止密码子),由此认为,甜菜夜蛾体内具有内源性piggyBac类似因子,但本研究所克隆的拷贝SePLE1和SePLE2已经丧失了转座活性。2棉铃虫piggyBac转座子基因的克隆与序列分析利用兼并引物PCR、inverse PCR和vectorret PCR技术,从棉铃虫的基因组中克隆获得了2个piggyBac类似因子基因的DNA全长,并分别命名为HaPLE1和HaPLE2。其中HaPLE1(GenBank accession number:EF593176)全长2500bp,含有编码597个氨基酸的1794bp开放阅读框(ORF),具有16bp末端反向重复序列(ITR)和piggyBac转座子家族特征性的TTAA插入序列。HaPLE1转座酶的氨基酸序列与其它昆虫piggyBac因子的相似性很高,与家蚕Bombyx mori的yabusame-1的相似性为46%,与烟芽夜娥Heliothisvirescens的HvPLE1的相似性为48%,与桔小实蝇Bactrocera dorsalis的piggyBac类似因子的相似性为67%,与粉纹夜蛾T.ni的IFP2的相似性为78%。同时HaPLE1推导的氨基酸序列中还具有可能构成DDD结构域的四个天冬氨酸D268,D346,D447和D450.由此认为HaPLE1是自主性因子,具有潜在的转座活性。而HaPLE2全长只有982bp,与HaPLE1的相似很高,并具有完全相同的ITR列和插入序列,但缺失了大部分的转座酶编码序列。3棉铃虫piggyBac基因旁侧序列的克隆进一步进行TE展示研究表明,棉铃虫piggyBac类似因子在基因组中的拷贝数较少,在同一品系的不同个体中有不同的插入位点。利用veetorret PCR克隆了12个棉铃虫个体中piggyBac转座子基因的旁侧序列,通过测序获得了12个5’上游旁侧序列和8个3’下游旁侧序列。序列分析表明,其中的11个5’上游旁侧序列和7个3’下游旁侧序列都属于HaPLE2.将获得的12个上游旁侧序列和8个下游旁侧序列,进行Blast同源性搜索,结果都没有找到相应的基因,表明piggyBac类似因子更倾向于插入基因间隔区或者基因非编码区,从而不影响基因功能或者正常表达。由此认为,piggyBac侵入棉铃虫种群历史不长,HaPLE1是棉铃虫的一个结构完整的piggyBac类似因子,可能仍然具有转座活性;而HaPLE2可能是由HaPLE1发生缺失和突变而来的非自主性转座子;这些转座子如果转座插入功能基因区,很可能产生致死效应。4 HaPLE1,HaPLE2在棉铃虫不同地理品系的分布在棉铃虫piggyBac类似因子HaPLE1和HaPLE2核苷酸序列的相同区域设计特异性引物,利用PCR方法调查这两个基因在三个不同的棉铃虫地理种群NJ品系,GY品系以及Oxford品系中的存在情况.结果发现HaPLE2因子存在于三个品系的所有被调查的棉铃虫个体,而HaPLE1存在于NJ品系35%的个体中,存在于GY品系35%的个体中,以及Oxford品系24%的个体中。由此我们可以得出以下两点推论:第一,piggyBac类似因子在二十年前就已经存在于棉铃虫的基因组中。因为Oxford品系是二十年前采集于自然界中,之后在室內连续饲养。第二,HaPLE1可能仍具有转座活性。因为当一个转座子失去活性时就被固定在基因组上,这个基因也会由于遗传而出现在下一代的基因组中,当在室內连续饲养几代之后,这个基因就会存在于几乎所有的个体中,而HaPLE1只存在于24-35%的棉铃虫个体的基因组中。5 piggyBac转座子基因的亲缘关系树分析收集各种数据库登录的来自11种生物的19个piggyBac类似因子的氨基酸序列,利用CLUSTALX1.8和MEGA3.1构建亲缘关系树,进行系统进化分析。结果显示,虽然已有的piggyBac转座酶大致归为三个大的类群(CladeⅠ,CladeⅡ,CladeⅢ)。但除了CladeⅠ全为来自昆虫的piggyBac类似因子(包括HaPLE1)外,CladeⅡ和CladeⅢ中既有昆虫的piggyBac因子又有哺乳动物的piggyBac因子,根据piggyBac因子相似性得出的物种之间的亲缘关系严重背离了宿主之间实际的亲缘关系。由此证实了piggyBac转座子在进化的过程中并不仅仅进行垂直遗传,也存在水平转移。此外,亲缘关系树研究还发现,来自同一物种的不同转座子,可以归为不同的类型,表明不同类型的piggyBac可以反复感染同一种群。6棉铃虫piggyBac在果蝇卵中的转座活性研究将从棉铃虫基因组中克隆到的两个piggyBac因子HaPLE1和HaPLE2分别构建成p3E1.2-CBW-1,p3E1.2-CBW-2两个质粒,通过电穿孔仪将质粒导入果蝇的胚胎,随后回收质粒,检测棉铃虫的2个piggyBac转座子在果蝇中的转座活性。结果发现HaPLE2构建的质粒在果蝇卵中没有剪切发生。但HaPLE1构建的质粒具有0.00025%的剪切频率,不过观察到的剪切位点均不是piggyBac转座子的经典剪切位点TTAA。由此认为,棉铃虫基因组中克隆到的piggyBac因子HaPLE1可能具有转座活性,但目前尚不能肯定,尚需进一步验证,piggyBaC转座子能否导致非常规的剪切,也需要进一步证实。综上所述,本究调查确定了鳞翅目两种重要农业害虫甜菜夜蛾和棉铃虫具有内源性piggyBac类似因子,并且从棉铃虫中获得了一个结构完整,具有潜在活性的piggyBac转座子。这一结果为夜蛾类昆虫的转基因研究,以及开发新的更高效的piggyBac转基因载体,奠定了坚实的基础。