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酸土环脂芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris），俗称耐热菌，因其耐热耐酸的特性可经受果汁巴氏杀菌过程而存活，在合适的条件下，可迅速生长繁殖而导致果汁感官品质的劣变。在浓缩苹果汁出口时，国外厂商要求在10mL浓缩汁中该菌含量不大于一个。目前，国内外对此菌的检测方法都采用传统的细菌培养平皿记数法，培养周期长（4-5天），操作繁琐，成为果汁厂质量控制程序中的滞后环节。要解决浓缩果汁中耐热耐酸菌的检测手段远远滞后于生产的矛盾，就必须研究其快速检测技术。 聚合酶链式反应（PCR）技术是一种快速、灵敏的微生物的检测方法，可在数小时内，将靶序列特异性扩增至百万倍以上，达到检测目的。采用PCR技术检测苹果浓缩汁中的耐热菌已有一定进展，但需预增菌15h，整个检测时间仍较长，且只是定性，不能定量。 本实验在前人工作的基础上，采用各种方法，提高PCR检测的灵敏度，希望不经增菌，直接扩增靶序列到可检测水平，进一步完善定性系统，首次采用竞争定量PCR，建立果汁中耐热菌的定量检测方法。即，构建竞争模板，使已知量的竞争模板与未知量的靶序列在同一反应体系中扩增，达到对靶序列的定量。通过研究，得到了以下结论： 1．研究了煮沸裂解法、微波法、超声法、酶煮沸裂解法、经典酶法、SDS法、CTAB法、改进CTAB法、氯化苄法、氯仿直接提取法等多种模板制备法，结果表明，氯化苄法能够获得较好质与量的PCR反应模板。其步骤及优化参数如下：集菌，沉淀加入250μL的TE，50μLSDS和150μL氯化苄，混匀，50℃温浴1h。加入150μL3M的NaCI，冰浴15min。8000转离心10min，取上清加0.6体积异丙醇，轻摇均匀至DNA沉淀下来，12000转离心10min，弃上清。用体积分数70％的乙醇洗沉淀，12000转离心2min，2次，适当体积的TE缓冲液溶解沉淀。 2．改进的25μLPCR优化体系：Taq酶用量为1.4U，Mg2+浓度为2.0mmol／L，使用10％甘油作促进剂。 3．采用热启动与降落PCR体系，可大幅度提高检测灵敏度。热启动PCR，在冰浴上混匀各成分，当PCR仪温度升至70℃以上时加样扩增；降落PCR，退火温度从60℃降落到50℃。采用上述优化体系后，检测灵敏度由104提高到101，能够检测到5x10‘个目标模板T，但扩增条带非常微弱，以5x102个目标模板T扩增时，结果较为稳定。 4.首次设计了引物3，与引物1配对，通过一轮PCR得到竞争模板C，通过温度梯度PCR获得此反应的最佳退火温度为58℃。以引物1、引物2扩增C、T，对凝胶电泳结果分析，C具有和T一样的与引物1、引物2结合的位点，C、T相差约50bp，验证了c为所需竞争模板。 5.以5x10s5xl价的C、T对应浓度共扩增，及sxioZT与5x105sx1护的c共扩增，sxio4T与5xl护5xl护的c共扩增，结果证明c与T的扩增效率较为一致。C与T在同一反应体系中共扩增的检测低限为5 xl护个靶分子，初步建立了耐热菌PCR定量方法。 6.运用本试验研究所建立的竞争定量PCR检测到培养样品与人工回添果汁中5 xl护、5xl了个的耐热菌。本竞争定量PcR体系目前还不能运用到浓缩苹果汁中耐热菌的检测，有待进一步研究改进。