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我们实验室引进了一种绿色荧光蛋白转基因大鼠,部分转基因大鼠出现EOB(eye-open at birth)表型,即出生时动物眼睑是睁开状态。通过反向PCR的方法发现是SPNS2(spinster homolog 2)基因发生突变。SPNS2是S1P(sphingosine1-phosphate,1-磷酸鞘氨醇)的一种转运体,可以将S1P转运到细胞外。S1P通过和细胞表面的五种S1P受体(S1P Receptors,S1PRs)结合,启动下游信号通路,引发细胞的增殖、分化和迁移等生理活动。哺乳动物胚胎眼睑在发育中经历一个闭合以及随后再睁开的过程。大鼠和小鼠眼睑发育的表现为:胚胎发育后期,眼睑闭合;动物出生时眼睑依然闭合,直到出生后2周左右眼睑重新睁开。如果眼睑闭合发生障碍,便会出现EOB表型。目前研究发现有几个重要的信号通路参与眼睑发育过程,然而目前SPNS2影响眼睑发育的分子机制并不清楚。本研究用出现EOB表型的大鼠作为动物模型,研究SPNS2在眼睑发育中的作用机制;取得的主要研究结果如下:1)通过系统的交配,我们发现,EOB表型是一种与绿色荧光蛋白连锁的可遗传的性状,并且符合孟德尔遗传规律。通过反向PCR的方法定位了转基因载体p CX-EGFP的插入位点,并且用Southern blot验证了转基因载体在转基因大鼠中只有一个插入位点。通过序列分析,发现插入位点附近有一个基因:SPNS2。转基因载体插入到SPNS2的第一个内含子中,破坏了SPNS2的基因结构。RT-PCR的结果显示在EOB大鼠中,SPNS2没有表达。因此,我们建立唯一的大鼠SPNS2突变模型和大鼠EOB模型。2)通过组织石蜡切片和原位杂交我们发现SPNS2在眼睑上皮细胞中表达,SPNS2-/-大鼠眼睑不能形成Leading Edge。孕鼠羊水中给予SPNS2的表达载体能够挽救EOB,SPNS2的突变是导致EOB出现的原因。3)孕鼠羊水中给予S1P和生长因子,都能够不同程度的挽救EOB表型;并且发现在WT和SPNS2-/-大鼠中EGFR(epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体)信号通路活化程度不同,证明了EGFR信号通路参与SPNS2的信号通路。采用体外培养皮肤角质细胞的方法发现S1P可以激活EGFR的下游分子Erk1/2、c-Jun;EGFR和S1PR的阻断剂实验,发现EGFR阻断剂可以阻断S1P对EGFR信号同路的激活,证明了S1P通过S1PR2-3反式激活EGFR信号通路。4)通过金属蛋白酶抑制剂阻断实验发现:Adam10的抑制剂阻断了S1P对EGFR信号通路的激活。酶活性检测实验显示:Adam17的酶活性在眼睑发育时期SPNS2-/-动物中低于野生型,证明了Adam10和Adam17都参与了S1PR对EGFR的反式激活过程。免疫组化和Western Blot实验显示调节Adam10/17活性的Timp3的表达量在SPNS2-/-大鼠中高于野生型,证明Timp3参与到SPNS2影响眼睑发育过程中。综合以上结果,我们可以推测SPNS2在眼睑发育过程中的机制:SPNS2转运S1P到细胞外,S1P和细胞膜上的S1PR2和S1PR3结合,激活G蛋白,进而调节Adam10/17的酶活性,剪切HB-EGF等生长因子。生长因子和细胞表面的EGFR结合,激活EGFR信号通路,活化下游的ERK1/2、c-Jun等分子,促进基因转录,细胞分裂、迁移等生理活动,使眼睑上皮细胞增殖迁移,最终上下眼睑闭合。在SPNS2-/-大鼠中,SPNS2的转运功能被破坏,S1P不能分泌到细胞外,导致下游的信号中断;并且由于某种机制导致TIMP3的表达增多,进一步抑制Adam10/17的活性,导致后面的信号途径失活,产生EOB表型。在本研究中,SPNS2基因缺陷大鼠和EOB动物模型的发现、建立以及EOB分子机制的解析,有助于解析SPNS2和S1P的功能,进一步探究眼睑发育过程,为治疗人类先天眼睛发育疾病提供理论依据,有着重要的研究意义。