整合生物加工(CBP)工艺是木质纤维素生物炼制过程中一种重要策略。在利用纤维素类底物进行微生物发酵的过程中,用于CBP过程的菌株通常集成了纤维素酶生产、纤维素类水解以及单糖发酵三个功能,以此减少甚至替代发酵过程中纤维素酶的使用,从而降低生物炼制加工成本。虽然自然界很少存在具备CBP齐全功能的野生菌种,但是随着近年来人们在能源微生物领域研究的逐渐深入和基因工程技术的日趋成熟,人们在CBP菌株的构建方面开始有越来越多的积累和认识,许多有CBP潜力的微生物正在被进行各方面的研究,以获得合适的CBP发酵菌株并在大规模发酵过程中进行应用。大肠杆菌(Escherichia coli)具备极其良好基因工程改造性能,虽然野生型的大肠杆菌不具备产纤维素酶的能力以及高附加值产物的发酵生产能力,但是由于其易于改造,所以可以通过基因工程的手段将其改造成为一株CBP菌株。实验中,首先通过在大肠杆菌基因组中整合源自运动发酵单胞菌的醇脱氢酶(adhB)基因和丙酮酸脱羧酶(pdc)基因,从而在大肠杆菌中引入乙醇的生产途径,使其能够利用碳源进行乙醇发酵生产。在此基础上,我们又利用有效的启动子和信号肽,在重组产乙醇大肠杆菌中分别分泌表达了不同的纤维素酶基因：源自热纤梭菌的内切葡聚糖酶基因(celA)、外切葡聚糖酶基因(cbhA)以及源自多黏芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因(bglB)。三种基因的重组菌都表现出了对应纤维素酶的分泌表达特性,并在发酵过程中体现了对相应底物的利用能力和乙醇生产能力。然而,大肠杆菌虽然具有良好的外源基因表达能力,但是其分泌能力并不理想,为了改善重组菌纤维素酶的分泌情况,我们在又尝试了在发酵过程加入添加剂的策略,以期其能增加细胞通透性并促进纤维素酶的分泌表达。通过实验我们在几种添加剂中确定EDTA具有最好的效果,并在表达bglB基因的产乙醇重组大肠杆菌利用纤维二糖发酵产乙醇的过程中表现出厂明显的效果,将其胞外分泌率从0.79%提高到了6.69%,在发酵中促进了底物纤维二糖的利用并提高了乙醇的生产。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是一种革兰氏阴性菌,通过ED途径专一地利用葡萄糖、果糖和蔗糖进行乙醇发酵,能够得到接近理论产量的乙醇。同时,运动发酵单胞菌还拥有良好的产物耐受性、低量氧气需求等性能,因而成为一株优良的乙醇发酵菌株。但是运动发酵单胞菌缺乏对纤维素类底物的利用能力和相关的纤维素降解基因。基于此,本论文通过基因工程改造的手段,在运动发酵单胞菌中尝试新的表达策略,进行了β-葡萄糖苷酶基因bglB的表达。首先我们通过内源性沉默纤维素酶基因ZMO1086的过表达,确认了纤维素酶在运动发酵单胞菌中表达的可能性并对其分泌表达的情况进行了研究；接着,利用ZMO1086的信号肽成功地将bglB在运动发酵单胞菌中进行了分泌表达,酶活达到2.5 U/g DCW,分泌率达到约16%。同时,发现bglB能够通过和宿主菌中的果聚蔗糖酶基因sacB进行融合,进而以融合蛋白的形式进行分泌表达。虽然酶活达到了更高的5.3 U/g DCW,但是分泌率仅为2%左右。表达bglB基因的相应重组菌在利用纤维二糖的发酵试验中,体现出了一定的纤维二糖利用能力。本实验研究了外源纤维二糖酶在运动发酵单胞菌中分泌表达情况,测试了两种新的分泌表达策略,为今后运动发酵单胞菌中纤维素酶表达的实验提供了基础和思路。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)也是一种拥有成熟的基因改造系统的菌株,并具有相当良好的蛋白分泌性能。同时该菌株在生长过程中也能进行一些诸如丁醇、乳酸等物质的生产。研究发现了一个源自热纤梭菌的p-1,3-1,4-葡聚糖基因licB,并在枯草芽孢杆菌中进行了分泌表达。licB基因在表达后表现出了相当优秀的耐热性能,最适酶活性高达80℃,且分泌到胞外的蛋白在70℃下半衰期达到5h；同时LicB在pH 4-11的范围内都有很好的催化表现,并不易受金属离子的影响,仅Cu2＋和Fe2+会对其酶活产生比较明显的抑制。良好的耐热性能以及广泛的pH适性使得LicB蛋白拥有相当广阔的应用前景,而枯草芽孢杆菌对纤维素酶表现出来的良好的表达和分泌性能也能在CBP发酵应用中起到重要的作用。本研究文论通过对运动发酵单胞菌、大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌这些潜在的CBP菌株进行了基因工程改造,尝试并实现了不同的纤维素酶基因在不同菌体中的表达,研究了菌体中纤维素酶分泌的情况并进行了一些CBP发酵的尝试和改进。通过实验我们总结了一些CBP基因工程菌研究的基本规律,为实现CBP基因工程菌的构建和应用打下了基础。