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研究背景日本血吸虫病(Schistosomiasis japonica)是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,它严重危害了疫区群众身体健康并影响了社会经济的发展。迄今为止,我国开展了半个多世纪的血吸虫病防治工作,并取得了举世瞩目的成绩。但由于日本血吸虫病流行的影响因素复杂,目前仍然是我国湖南、湖北、江西、安徽、江苏湖区5省和山区2省主要公共卫生问题之一。近年来,采取的以控制传染源为主的综合防治策略,虽然在疫情控制地区已经显示出了较好的防治效果,但仍未脱离以传播生态学为原理的思维模式。防治实践表明,依据疾病传播生态学原理设计的综合防治措施固然有效,但效果难以持久巩固,容易受到自然生态环境及防治投入力度变化的挑战。鉴于疫苗在预防、控制许多传染病中已证明其巨大的作用,因此,研制抗血吸虫病疫苗,弥补常规药物化疗短期效果的不足,发挥疫苗接种诱导的长期免疫预防效果,通过二者的双重效益来实现对血吸虫病长期控制效果,是近20-30年来我国乃至世界各国有关科学家共同的奋斗目标之一,也正是WHO/TDR自上个世纪80年代以来在世界范围内为协调血吸虫病疫苗研制所做努力的初衷。成熟虫卵是血吸虫病致病的主要因素和传播的唯一因子。因此,本室血吸虫病疫苗的研究主要集中于抗雌虫生殖、抗卵抗病免疫方面。近十年来,本课题组的研究结果已经证明了未成熟虫卵可溶性抗原(Soluble immatured egg antigen, SIEA)免疫可诱导动物机体产生抗虫卵胚胎发育和抗雌虫生殖产卵的效果,SIEA诱导产生的体液免疫应答,在抗血吸虫病保护性免疫中起着重要作用。抗SIEA免疫血清能够与虫卵内胚胎结合,抑制和干扰虫卵胚胎的发育；还能与雌虫卵黄腺及肠腔内膜组织结合,降低雌虫的生殖产卵功能。进一步的研究发现SIEA中26-28 ku分子抗原是诱导抗病保护性体液免疫应答中的主要效应分子之一。课题组前期应用噬菌体展示技术成功构建了日本血吸虫未成熟卵单链抗体库,获得了针对SIEA26-28 ku的特异性单链抗体(single chain antibody, scFv),为日本血吸虫治疗性疫苗的研制打下了基础。研究目的大量表达SIEA26-28 ku-scFv和EGFP-scFv,通过柱层析法纯化蛋白,研究其抗体特异性以及靶向免疫作用效果；并将SIEA26-28 ku-scFv与DNA双价疫苗及其对应的蛋白疫苗联合使用,观察其抗病免疫的保护效果及其免疫效应机制。研究方法1、大量表达并纯化SIEA26-28 ku-scFv和EGFP-scFv,并测定其抗体特异性。大量培养带有pET32a/SIEA26-28 ku-scFv质粒和pET32a/EGFP-scFv的BL21(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导SIEA26-28 ku-scFv和EGFP-scFv表达。用两步纯化法纯化目的蛋白。将纯化蛋白进行SDS-PAGE(或HPLC)纯度检测、Western blot鉴定、蛋白浓度测定,采用非竞争酶免疫法测定纯化后单链抗体的亲和常数。2、特异性SIEA26-28 ku单链抗体的靶向定位应用酶免疫组织化学法、间接免疫荧光法,观测特异性SIEA26-28ku单链抗体针对血吸虫雌虫及虫卵抗原的靶向定位情况。3、特异性SIEA26-28 ku单链抗体作为治疗性抗体及与疫苗联合免疫小鼠保护性效果的观察。4、特异性SIEA26-28 ku单链抗体作为治疗性疫苗联合免疫牲猪的抗病效果及其效应机制的研究。研究结果1、以pET32a质粒作为载体,构建了可溶性表达SIEA26-28 ku-scFv的工程菌株,通过Ni2+螯合亲和层析法再结合DEAE阴离子交换层析,两步纯化即可得到纯度达到98.2%的单链抗体,通过Western blot和ELISA检测证明单链抗体与日本血吸虫SIEA抗原具有高度特异性。2、SIEA26-28 ku-scFv与血吸虫未成熟虫卵、成熟虫卵及雌虫生殖系统特异性结合,结合部位主要在虫卵卵胚、雌虫卵黄腺、卵巢、子宫内卵及与生殖系统邻近的肠壁内膜。与正常人肝组织蛋白、正常鼠肝组织蛋白无交叉反应。3、SIEA26-28 ku-scFv治疗性抗体对昆明小鼠免疫保护效果：该单链抗体与DNA疫苗联用时可显著提高小鼠抗血吸虫病的免疫保护性作用,小鼠血清滴度达到1：6400,减虫率达61.4%、肝减卵率为51.2%、肠减卵率为56.6%、每雌子宫虫卵数降低54.2%,所有数值均较其它单一疫苗组高,而且肝脏血吸虫虫卵肉芽肿直径和面积均较其它单一疫苗组低。4、SIEA26-28 ku-scFv与疫苗联合应用时可明显升高猪外周血和脾细胞CD4+T细胞数和CD4+／CD8+比值,促进机体IFN-γ表达,对IL-4表达影响不明显。实验中发现,该单链抗体的单一使用虽可对感染后的猪起到一定的抗病效果,但其效果不及联合免疫组。结论1、成功构建了可溶性表达SIEA26-28 ku-scFv的工程菌株,并纯化目的蛋白。纯化后蛋白纯度高达98.2%。2、SIEA26-28 ku-scFv与血吸虫未成熟卵具有高度靶向特异性,与血吸虫结合部位主要在虫卵卵胚、雌虫卵黄腺、卵巢、子宫内卵及与生殖系统邻近的肠壁内膜。3、小鼠和猪实验表明,SIEA26-28 ku-scFv与疫苗联用可明显提高单一分子疫苗的免疫保护效果。其作用机制可能是通过其特异性的靶向作用而产生抗病效果。4、SIEA26-28 ku-scFv可明显升高猪血和脾细胞CD4+T细胞数和CD4+／CD8+比值,促进机体IFN-γ表达,对IL-4表达影响不明显,促进机体主要产生以Th1型优势为主的免疫应答。5、SIEA26-28 ku-scFv具有明显的免疫靶向效果,将其靶向作用与疫苗联合应用,可显著提高血吸虫病疫苗的抗病免疫效果。同时,抗血吸虫病疫苗与AHFP药物的联用同样具显著的抗病效果。