【摘 要】
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近年来,癌症的发病率和死亡率不断上升,癌症已经严重威胁人类的健康与生命。血清肿瘤标志物是临床上最理想的生物标记物之一,在肿瘤筛查、诊断、确定预后、监测治疗和检测复发等方面具有重要意义。如何更加灵敏、特异、简便、快速、精确定量和时实的检测血清肿瘤标志物,这是临床实验诊断需要解决的问题。核酸适体(Aptamer)作为体外人工筛选获得的一段寡聚核苷酸,它能够特异性结合蛋白质或其它小分子物质。然而,适体本
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近年来,癌症的发病率和死亡率不断上升,癌症已经严重威胁人类的健康与生命。血清肿瘤标志物是临床上最理想的生物标记物之一,在肿瘤筛查、诊断、确定预后、监测治疗和检测复发等方面具有重要意义。如何更加灵敏、特异、简便、快速、精确定量和时实的检测血清肿瘤标志物,这是临床实验诊断需要解决的问题。核酸适体(Aptamer)作为体外人工筛选获得的一段寡聚核苷酸,它能够特异性结合蛋白质或其它小分子物质。然而,适体本身光电信号弱,在适体传感器构建中往往需要通过适当方法进行信号放大。量子点(QDs)是最常用的荧光探针之一,其宽激发、窄发射、以及高量子产率的特点使QDs被广泛用于荧光传感器研究领域。本文基于荧光共振能量转移(FRET)效应,构建两种QDs/WS2/Fe3O4荧光增敏型适体传感器,分别实现CA19-9单独检测和AFP、CA19-9同时检测。论文主要研究内容如下:(1)GQDs/WS2/Fe3O4荧光增强型适体传感器构建及CA19-9检测采用水热法合成了羧基化石墨烯量子点(GQDs-COOH)和二硫化钨(WS2)纳米片,为了提高GQDs-COOH荧光量子效率,在其表面修饰上聚乙二醇(PEG),共价偶联适体得到的GQDs-PEG-Apt作为CA19-9特性识别和能量供体;以载有四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒与WS2纳米片形成的Fe3O4/WS2纳米复合物为能量受体,构建了荧光适体传感器。当样品中无靶标CA19-9时,能量供体与受体间FRET效应令GQDs-PEG-Apt荧光猝灭,当样品有CA19-9时,GQDs-PEG-Apt与靶标结合并脱离Fe3O4/WS2纳米复合物,体系荧光得以恢复;经磁性分离后,传感体系上清液荧光强度随CA19-9浓度增大而增强,CA19-9浓度在1.995~1000 U/m L范围内体系荧光相对恢复率与CA19-9浓度对呈良好的线性关系,检测限为0.01 U/m L。该传感器具有良好的特异性,可实现人血清肿瘤标志物CA19-9定量检测,RSD在1.09~4.51%,回收率在90.21~99.33%。(2)QDs/WS2/Fe3O4双重荧光增强型适体传感器构建及AFP和CA19-9同时检测以WS2/Fe3O4纳米复合物为单一能量受体,两种荧光发射波长相差较大的蓝色荧光量子点(GQDs-PEG)和红色荧光Cd Te量子点(RQDs)偶联的GQDs-PEG-Apt1、RQDs-Apt2分别作为AFP和CA19-9特异性识别分子和双重能量供体。由于受体与适体之间π-π堆积作用以及FRET,当受体WS2/Fe3O4纳米复合物加入到体系中时,GQDs-PEG-Apt1和RQDs-Apt2荧光同时被猝灭;当样本中存在AFP和CA19-9时,供体与受体分离,体系荧光强度得以恢复;磁分离后,体系上清液荧光强度随AFP和CA19-9浓度增加而增大。检测条件经过优化后,AFP浓度在5~1000 ng/m L、CA19-9浓度在5~1000 U/m L范围内,体系相对荧光强度与两种血清肿瘤标志物浓度具有良好线性关系,其检出限分别为0.5 pg/m L和0.396 m U/m L。该传感器具有良好的特异性,可实现人血清肿瘤标志物AFP和CA19-9同时定量检测,其中CA19-9的RSD在2.72~6.24%,回收率在95.13~100.89%,AFP的RSD在3.32~6.41%,回收率在91.92~99.28%。文中构建的QDs/WS2/Fe3O4荧光增强型适体传感器具有线性范围宽、灵敏度高、特异性强和稳定性好等特点,可用于临床实验诊断,具有临床推广应用价值。更换适配体序列,QDs/WS2/Fe3O4荧光增强型适体传感器还可用于其它靶标定量检测,这对于癌症诊断和加快实现健康中国战略方面具有重要意义。
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