论文部分内容阅读
木薯（Manihot esculenta Crantz,cassava）是世界七大作物之一,也是热带地区主要的粮食作物,然而干旱、盐碱、低温等环境因素导致木薯产量严重降低。前期研究表明选择性剪接参与许多生理反应过程,是响应非生物胁迫的一种重要转录后调控机制。富含丝氨酸和精氨酸的SR蛋白（serine/arginine-rich proteins,SR）是一类重要的剪接因子,其在植物响应非生物胁迫过程中具有重要作用。生物信息分析表明Me SCL30是木薯SR蛋白家族成员之一,因此本论文旨在解析Me SCL30蛋白的重要功能,获得的主要研究结果如下:1、克隆木薯Me SCL30蛋白编码区片段,并通过Gateway体系构建植物表达载体。通过农杆菌侵染转化到拟南芥中,筛选得到纯合株系进行后续表型分析。2、生物信息学分析表明:Me SCL30基因全长为816bp,编码271个氨基酸,富含53个带正电荷的Arg残基,蛋白大小约为31k D,等电点p I为11.16,含有7个外显子和6个内含子,是亲水的碱性蛋白。Me SCL30蛋白包含RRM结构域和RS结构域,与拟南芥At SCL30的亲缘关系最近。同时对Me SCL30基因启动子区顺式作用元件进行分析,结果发现有许多与非生物胁迫相关的元件,例如,热胁迫应答元件、低温响应元件和干旱应答元件,表明木薯Me SCL30可能参与逆境胁迫的响应。3、亚细胞定位结果表明:当转入空载体p GWB505（C-GFP）时,GFP不表达,细胞无荧光信号;当转入p GWB505:Me SCL30时,可以在细胞核中检测到荧光信号,说明Me SCL30是核定位蛋白。4、实时荧光定量PCR（q RT-PCR）结果表明:Me SCL30在木薯根、茎、叶中均有表达,且在茎中表达水平最高。在sorbitol、脱水（dehydration）、脱落酸（ABA）和氯化钠（Na Cl）处理条件下,Me SCL30的表达显著上调或下调,这些结果表明Me SCL30可能参与调控木薯响应非生物胁迫。5、通过q RT-PCR选取了表达量最高的两株拟南芥转基因株系,OX8和OX11。实验结果表明,在sorbitol胁迫处理后,转基因拟南芥的萌发率、根长和鲜重都显著高于野生型。在ABA胁迫处理后,转基因拟南芥的萌发率、根长和鲜重都显著低于野生型。表明过表达Me SCL30拟南芥比野生型拟南芥有更强的抗旱能力。6、通过对干旱处理后的过表达Me SCL30拟南芥和野生型拟南芥的存活率统计,以及叶绿素和花青苷含量的测定,结果发现在干旱处理后,过表达Me SCL30拟南芥的存活率明显高于野生型拟南芥,同时过表达Me SCL30拟南芥中的叶片叶绿素含量远高于野生型拟南芥,而野生型拟南芥花青苷含量高于过表达Me SCL30拟南芥。7、酶活试验测定结果表明:拟南芥过表达Me SCL30株系的过氧化氢酶（catalase,CAT）活性和过氧化物酶（peroxidase,POD）活性都比野生型高,双氧水（hydrogen peroxide,H2O2）含量比野生型低。表明在干旱胁迫下Me SCL30的过表达可以减少氧化损伤,进而提高抗旱性。8、通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试验研究了在选择性剪接水平上,Me SCL30基因对一些非生物胁迫和ABA的响应程度。结果表明各种非生物胁迫和ABA对Me SCL30基因的剪接过程都有不同程度的影响。9、我们用300m M sorbitol处理长势相似的过表达拟南芥和野生型拟南芥。q RT-PCR试验结果表明,两个过表达Me SCL30株系中干旱胁迫响应相关基因NCED3和RD29A的表达量都显著高于野生型拟南芥。