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膀胱癌是第二常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤。随着年龄的增长,男性和女性的发病率逐渐增加。男性发病率约为女性的三倍。在美国,2012年约50,000男性和17,000名女性患膀胱癌。对香烟及工作环境致癌物的过度暴露或泌尿系统感染可能引起男性高患病率。然而,即使在缺乏这些危险因素的情况下,与性别有关的发病率的差异依然存在。因此,男女患者间的性激素及其受体的差异可能是膀胱癌发生率性别差异的潜在因素,然而有关此方面的证据仍较少。第一部分雌激素受体α(ERα)抑制膀胱癌细胞侵袭目的：探讨ERα与膀胱癌细胞侵袭的关系方法：首先稳定转染ERa或空载体质粒(vector)进入膀胱癌细胞。嘌呤霉素筛选5天后,免疫荧光测转染效率。并收集蛋白,Western Blot进一步证实转染效率。同时利用RNA干扰技术,选择性的沉默人膀胱癌细胞株647v中ERα基因的表达。之后,使用3种ERa阴性膀胱癌细胞株(T24,UMUC3和J82)和一种ERa阳性膀胱癌细胞株(647v)进行Transwell侵袭实验。三维侵袭实验进一步验证这些膀胱癌细胞株的侵袭能力。结果：1.成功建立了稳定转染ERα及shERα的膀胱癌细胞株。2.采用Transwell系统研究ERα对膀胱癌细胞侵袭的影响。在T24细胞中过表达ERα,抑制癌细胞的侵袭。用另外两个膀胱癌细胞株UMUC3和J82进行侵袭实验也得到了类似的结果。另外,降低ERa在647v细胞的表达增加膀胱癌细胞的侵袭。3.相似的,采用三维侵袭实验,证明在UMUC3细胞过表达ERα抑制或敲除647v细胞中ERα增强膀胱癌细胞的侵袭。结论：细胞侵袭实验和三维侵袭实验的结果显示ERα抑制膀胱癌细胞的侵袭。第二部分ERα敲除鼠模型建立及ERα抑制膀胱癌侵袭目的：建立雌激素受体α基因敲除鼠(ERaKO)模型并体内研究ERα与膀胱癌侵袭的关系方法：建立ERaKO鼠需要两代,我们首先交配ERαfl/fl的雄性鼠与CMV-Cre转基因雌性鼠,以获得CMV-Cre/ERafl/+鼠(F1)。再交配ERαfl/fl雄性鼠与CMV-Cre/ERafl/+雌性鼠(F1),得到ERαfl/+(野生型,WT)和CMV-Cre/ERαfl/fl (ERaKO)鼠(F2)。自6周至18周,每日饮水中喂0.05%N-丁基-N2(4-羟丁基)亚硝胺(BBN)以诱导膀胱癌发生。在28周(雄鼠)和38周(雌鼠)测血尿,30周(雄鼠)和40周(雌鼠)处死鼠并取膀胱进行H&E染色以比较肿瘤的侵袭性。在30周(雄鼠)和40周(雌鼠)观察小鼠的生存率。运用Kaplan-Meier生存曲线分析两组间的生存率差异。结果：1.通过交配ERαfl/fl雄性鼠与CMV-Cre/ERafl/+雌性鼠成功建立ERaKO鼠,基因型分析证实该鼠内ERa基因缺失。2.喂养0.05%BBN诱导WT鼠和ERaKO鼠发生膀胱癌。结果表明,相比WT鼠,ERaKO鼠有较严重的血尿。更重要的是,取膀胱组织进行H&E染色的组织学检查显示,ERaKO小鼠与野生型小鼠相比,更多进展为肌层浸润性肿瘤。3. Kaplan-Meier生存曲线显示,ERaKO小鼠生存率显著低于野生型小鼠。结论：BBN诱导膀胱癌后,相比WT鼠,ERaKO鼠肿瘤具有较高侵袭性且预后较差。第三部分ERa调节IGF1、MMP2表达抑制膀胱癌侵袭目的：ERa抑制膀胱癌侵袭的机制研究方法：1.首先稳定转染ERa或vector进入UMUC3膀胱癌细胞,应用qPCR检测侵袭相关因子在两组细胞中的表达差异。2.应用T24,647v细胞进一步验证筛选结果。3.为研究筛选出的胰岛素样生长因子1(IGF1),基质金属蛋白酶2(MMP2)表达,10ng/mlIGF1处理UMUC3ERa/vector细胞8小时,Western Blot检测MMP2蛋白表达,Transwell侵袭实验研究细胞侵袭性。4.50μM MMP2特异性抑制剂ARP-100处理647v shERa细胞12小时,Transwell侵袭实验研究细胞侵袭性。5.免疫组化检测WT鼠和ERaKO鼠肿瘤中ERα、IGF1和MMP2表达。结果：1.qPCR检测侵袭相关因子,转染ERa进入UMUC3膀胱癌细胞降低IGF1和MMP2表达。2.在T24细胞中,过表达ERα降低IGF1和MMP2表达；647v细胞中,抑制ERα增强IGF1和MMP2表达。3.IGF1处理UMUC3ERa/vector细胞,MMP2表达增高。4.IGF1处理UMUC3ERa细胞,逆转ERa对膀胱癌细胞侵袭的抑制作用。5. MMP2特异性抑制剂ARP-100处理647v shERa细胞,逆转shERa对膀胱癌细胞侵袭的促进作用6. ERaKO鼠无ERα表达,且相比WT鼠,肿瘤中IGF1和MMP2表达增高。结论：ERa通过下调IGF1进而降低MMP2表达抑制膀胱癌的侵袭。第四部分ERa激动剂体外和体内治疗膀胱癌目的：研究ERα激动剂在体外和体内的治疗效果。方法：1.体外实验,10%活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清(CD-FBS)培养647v细胞3天,对照组DMSO处理,实验组10nM ERa激动剂丙基吡唑三醇(PPT)处理,24小时后进行Transwell侵袭实验。2.体内实验,B6雌鼠(n=52),自8周至20周,每日饮水中喂0.05%BBN诱导膀胱癌发生。52只小鼠随机分为两组,DMSO处理组及PPT治疗组。自32周起,每两日50μl的DMSO/PPT (210-4M)腹腔注射。治疗60天后处死小鼠并取膀胱组织,H&E染色以比较肿瘤的侵袭性。运用Kaplan-Meier生存曲线分析两组间的生存率差异。结果：1.相比于DMSO组,PPT处理后的647v细胞侵袭性减低。2.体内实验得到相同结果：H&E染色的组织学检查显示,DMSO处理组比PPT治疗组鼠膀胱肿瘤更多进展为肌层浸润性肿瘤。3. Kaplan-Meier生存曲线显示,PPT治疗组小鼠生存率较好,但差异无统计学意义。结论：体内及体外实验均证实,ERα激动剂PPT抑制膀胱癌侵袭性。