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[目的]
EB病毒以潜伏感染形式寄存在EB病毒相关肿瘤细胞中,NF-κB起着关键性作用。抑制NF-κB活性能够诱导朗病毒进入溶菌循环,并对肿瘤细胞产生溶菌毒性。有研究表明,阐明小白菊内酯(parthenolide,PN)具有抑制NF-kB的作用。本课题旨在探讨PN对EB病毒阳性伯基特淋巴瘤的抑制作用,以及对肿瘤细胞中EB病毒溶菌循环的诱导作用和溶菌毒性,并对其机制作初步探讨,进一步研究PN以及联合抗病毒药物治疗EB病毒阳性伯基特淋巴瘤的可行性和临床应用价值。
[方法]
通过描绘细胞生长曲线、MTT的方法观察PN对Raji细胞的生长和活性抑制情况;annexin V-PI和DAPI染色观察PN对细胞的促凋亡作用;流式细胞技术分析PN对Raji细胞周期的影响;Western-blot检测PN作用后caspase表达;RT-PCR分析不同浓度PN作用后BZLF1、BRLF1基因表达;使用ELISA方法检测不同浓度PN作用后细胞内NF-kB(p65)活性的变化;western-blot分析PN作用前后胞浆、胞核中NF-κB量的变化;MTT法分析PN与更昔洛韦合用对Raji细胞毒作用。
统计学处理:数据统计分析采用SPSS13.0统计软件包进行处理,实验所得数据以均数士标准差(-x±SD)表示,多组间比较采用One-wayANOVA统计方法分析,p<0.05为差异具有统计学意义。
[结果]
1.PN抑制Raji细胞增殖。MTT结果显示使用4umol/L、6umol/L、8umol./L、12umol/L PN处理Raji细胞后,其增殖能力显著抑制,48小时抑制率分别为0.37±0.04、0.4375±0.1、0.59±O.1、0.97±0.02(p<0.05)(MTT分析)
2.PN诱导Raji细胞凋亡。DAPI染色显示PN处理组凋亡细胞比例明显高于对照组,armexin V-PI标记流式细胞仪检测结果.0 umol/L、4 umol/L、6 umol/LPN作用Raji细胞48小时后凋亡细胞数分别为:3%±2%、26%±2%、37%±3%.
(流式细胞术分析)
3.PN导致Raji细胞周期阻滞。流式细胞仪检测细胞周期显示PN处理组G0/G1期细胞数增多。(流式细胞术分析)
4.PN诱导Raji细胞凋亡通过线粒体途径。(Western-blot分析)
5.PN能够诱导Raji细胞进入溶菌循环。(RT-PCR法分析)
6.PN抑制NF-κB(p65)活性。Western-blot检测不同浓度的PN处理细胞后,与空白对照比NF-κB(p65)蛋白表达量在细胞核中明显减少,并且ELISE结果提示NF-kB(p65)活性明显被抑制。(Western-blot法分析、ELiSE法分析)
7.PN与更昔洛韦联合能够明显增强其对Raji细胞的毒作用。(MTT分析)
结论:小白菊内酯对朗病毒相关伯基特淋巴瘤细胞具有细胞毒性及溶菌毒性,联合抗病毒药物是治疗EB病毒相关伯基特淋巴瘤的一种新方法。