目的:本课题主要测定镓类化合物单用、氟康唑单用和镓类化合物联合氟康唑对氟康唑敏感和耐药念珠菌的体内、体外作用,并探索镓类化合物发挥抗念珠菌活性的可能机制。方法:1.镓类化合物对念珠菌体外作用研究根据CLSI M27-A3方案,用棋盘法对镓类化合物单用、氟康唑单用、镓类化合物联合氟康唑抗念珠菌(氟康唑敏感白色念珠菌、氟康唑耐药白色念珠菌、氟康唑耐药光滑念珠菌和天然耐药克柔念珠菌)浮游菌的静态作用进行研究,96孔培养板35℃环境中恒温培养24h。用XTT-甲萘醌避光孵育2h后在492纳米处用酶标仪测定每个孔的OD值。利用抑菌浓度指数法(FICI)和生长率差值法(ΔE)评价药物联用和药物单用时的抗念珠菌作用。利用时间-杀菌曲线法,分别在0h,12h,24h,36h,48h取样后用酶标仪在492nm处检测OD值,35℃环境中恒温培养24小时。用XTT-甲萘醌避光孵育2小时后在492nm处用酶标仪检测每个孔的OD值。绘制时间-杀菌曲线。根据CLSI M27-A3方案,使用96孔培养板测定镓类化合物的最低生物膜抑菌浓度,分别制成4小时,8小时,12小时,24小时,48小时生物膜后,镓类化合物干预,96孔培养板35℃环境中恒温培养24小时。用XTT-甲萘醌避光孵育2小时后在492纳米出用酶标仪检测每个孔的OD值。用生长率差值法(ΔE)评价镓类化合物抗耐药念珠菌生物膜作用。2.硝酸镓对耐药白色念珠菌的体内作用研究使用大蜡螟模型对镓类化合物的体内作用进行研究,每组20只。用5×10~6CFU浓度的耐药白色念珠菌感染大蜡螟,3小时后,64μg/ml到16μg/ml的硝酸镓溶液干预,大蜡螟幼虫的生存情况观察96小时,使用SPSS statistics 17.0软件绘制生存曲线,进行统计分析。在上述实验感染大蜡螟后的第2天,从每组中取出2只耐药白色念珠菌感染的大蜡螟。用组织液包埋大蜡螟后冷冻,用冰冻切片机切片然后苏木精染色液染色,观察大蜡螟的病理组织学变化。3.镓类化合物抗耐药白色念珠菌机制研究机制研究分为两个方面,借助卵黄琼脂培养基测定胞外磷脂酶活性、通过CAS载铁蛋白检测平板测定耐药白色念珠菌载铁蛋白的表达量。卵黄琼脂培养基测定耐药念珠菌的胞外磷脂酶活性实验中,通过PZ值的大小评价镓类化合物对耐药白色念珠菌胞外磷脂酶活性的影响。CAS载铁蛋白检测平板测定载铁蛋白表达量的实验中,向CAS平板中加入不同浓度的硝酸镓溶液,观察铁载体分泌圈的大小,判断耐药念珠菌铁载体的分泌情况。结果1.镓类化合物抗念珠菌体外作用研究镓类化合物单用对敏感白色念珠菌、耐药白色念珠菌、耐药光滑念珠菌、克柔念珠菌都有良好的抗菌活性;镓类化合物与FLC联用时,对敏感白色念珠菌、耐药白色念珠菌、耐药光滑念珠菌、克柔念珠菌均表现为无关或相加作用。氟康唑对敏感白色念珠菌的MIC值为0.125μg/ml-0.5μg/ml,硝酸镓对敏感白色念珠菌的MIC值为8μg/ml-16μg/ml,氯化镓对敏感白色念珠菌的MIC值为4μg/ml-8μg/ml。氟康唑对耐药白色念珠菌的MIC值为512μg/ml,硝酸镓对耐药白色念珠菌的MIC值为16μg/ml-32μg/ml,氯化镓对耐药白色念珠菌的MIC值为8μg/ml-16μg/ml。氟康唑对耐药光滑念珠菌的MIC值为64μg/ml,硝酸镓对耐药光滑念珠菌的MIC值为16μg/ml,氯化镓对耐药光滑念珠菌的MIC值为8μg/ml-16μg/ml。氟康唑对克柔念珠菌的MIC值为64μg/ml,硝酸镓对克柔念珠菌的MIC值为16μg/ml,氯化镓对克柔念珠菌的MIC值为8μg/ml-16μg/ml。动态研究表明:镓类化合物对氟康唑耐药的白色念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌都表现出较好的抗菌活性。时间杀菌曲线的实验结果与静态作用结果相一致,进一步验证了静态作用实验的结果。镓类化合物对耐药念珠菌4小时、8小时和12小时形成的早期生物膜具有较强的抑制作用,对24小时和48小时形成的生物膜抑制作用较差。氟康唑对耐药白色念珠菌、耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的生物膜最小抑菌浓度均≥512μg/ml。硝酸镓对耐药白色念珠菌CA10早期生物膜(4小时、8小时和12小时)的生物膜最小抑菌浓度为16μg/ml、32μg/ml和32μg/ml。氯化镓对耐药白色念珠菌CA10早期生物膜(4小时、8小时和12小时)的生物膜最小抑菌浓度为8μg/ml、16μg/ml和32μg/ml。硝酸镓对耐药光滑念珠菌CG2早期生物膜(4小时、8小时和12小时)的生物膜最小抑菌浓度为16μg/ml、32μg/ml和64μg/ml。氯化镓对耐药光滑念珠菌CG2早期生物膜(4小时、8小时和12小时)的生物膜最小抑菌浓度为16μg/ml、16μg/ml和64μg/ml。硝酸镓对克柔念珠菌CK8早期生物膜(4小时、8小时和12小时)的生物膜最小抑菌浓度为16μg/ml、32μg/ml和64μg/ml。氯化镓对克柔念珠菌CK8早期生物膜(4小时、8小时和12小时)的生物膜最小抑菌浓度为16μg/ml、16μg/ml和64μg/ml。2.硝酸镓抗耐药念珠菌体内作用研究大蜡螟幼虫的生存情况观察96小时,使用SPSS statistics 17.0软件绘制生存曲线,进行统计分析。体内作用的研究表明,硝酸镓干预后,念珠菌感染的大蜡螟生存率明显高于空白对照组,当硝酸镓浓度为64μg/ml时,和空白对照组的差异具有统计学意义(p<0.05)。硝酸镓溶液的浓度越高,念珠菌感染的大蜡螟生存率越高。使用包埋液将念珠菌感染的大蜡螟包埋并冷冻后用冰冻切片机进行组织切片。用苏木素对大蜡螟病理组织切片染色后荧光显微镜观察结果表明,使用硝酸镓溶液干预后大蜡螟体内的耐药白色念珠菌菌丝形成收到抑制,大蜡螟体内的组织破坏程度减轻。3.镓类化合物抗耐药白色念珠菌机制研究镓类化合物对耐药白色念珠菌胞外磷脂酶活性具有一定的抑制作用,随着镓类化合物浓度升高,磷脂酶活性也有小幅度的降低。硝酸镓加入到CAS载铁蛋白检测平板分析铁载体蛋白的表达,我们发现硝酸镓溶液能够上调耐药白色念珠菌CA10的载体蛋白表达量。我们猜测硝酸镓可能是通过与铁离子竞争性进入耐药念珠菌、阻断耐药白色念珠菌的铁离子代谢发挥抗菌作用。结论镓类化合物单用对敏感白色念珠菌、耐药白色念珠菌、耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的浮游菌有较强的抑制作用;镓类化合物和氟康唑联用时表现为无关或者相加作用。镓类化合物对耐药白色念珠菌、耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的早期生物膜(4h、8h和12h)有较强的抑制作用,对24h和48h生物膜抑制作用较微弱。硝酸镓溶液干预可以提高耐药白色念珠菌感染的大蜡螟的生存率,并随硝酸镓溶液浓度的升高,大蜡螟生存率升高。机制研究方面,硝酸镓能够减轻大蜡螟体内的组织破坏程度并可以上调念珠菌载铁蛋白的表达,由此猜测硝酸镓发挥抗真菌作用的机制可能是通过降低胞外磷脂酶活性和影响真菌的铁代谢。本课题的研究为研发新的抗真菌药物提供了新的思路。