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丙型肝炎病毒(HCV)所致的丙型肝炎(HC)是一种危害严重的传染病，HCV感染呈世界性分布，在我国HCV感染者约有4000万。为了控制HCV经血液传播，国家要求对献血者进行抗-HCV的检测。目前国内外HCV抗体检测试剂均已开发了三代产品。第三代ELISA检测试剂的质量，较前两代均有了很大提高，但还存在一定程度的漏检和假阳性，如何提高HCV抗体试剂的质量仍是一个亟待解决的问题。
在ELISA方法上，目前抗-HCV检测试剂均采用间接法，即用酶免疫标记的抗人IgG为第二抗体，检测血清中卜ICV抗体IgG。由于IgG抗体出现时间较晚，对早期感染易产生漏检；同时，由于血清中非特异性物质的吸附及类风湿因子等干扰，容易产生假阳性反应；另外，ELISA试剂盒使用的许多基因工程表达抗原都有融合末端，其抗原性可影响抗体检测，有时也会产生假阳性反应。
而双抗原夹心法ELISA使用的试剂从根本上更换了酶结合物质，使得试剂对受检样品的特异性大大提高；同时，双抗原夹心法ELISA检测的是总抗体，除IgG之外，还可以检测到IgM、IgA等。在感染早期，由于IgM抗体比IgG出现早，双抗原夹心法就可以缩短检测的窗口期，因而此种方法检测的敏感性高。应用双抗原夹心ELISA法来代替间接ELISA法，可以大大提高诊断试剂的敏感性与特异性，此法己在乙肝表面抗体、梅毒抗体、HlV抗体等的检测中得到了成功的应用，但在抗-HCV的检测中目前还处于研究阶段。
我们采用HCV 1-5基因型嵌合NS4抗原代替单一基因型的NS4抗原，以减少由于HCv基因变异对检测可能造成的影响；用融合六个组氨酸的抗原来包被酶标板，用融合GST的抗原来作酶标抗原，以消除融合末端对检测的影响。通过这些改进，本研究旨在建立一种敏感性高、特异性强的HCV双抗原夹心ELISA检测法，并初步探讨其在HCV抗体检测中的意义。本研究分为如下两个部分：
一、HCV不同基因编码区重组质粒的构建与重组抗原的表达和纯化：
以能表达lItCV core、NS3和NS4 GST融合蛋白的三种重组质粒C-pGEX-4T-2、NS3-pGEX-4T-2和NS4-pGEX-4T-2为模板，分别构建了能表达HCV core、NS3和NS4 His融合蛋白的另外三种重组表达质粒C-pET-28a-c(+)、NS3-pET-28a-c(+)和NS4-pET-28a-c(+)；重组质粒经PCR和双酶切鉴定，各重组质粒构建成功；重组质粒测序结果显示，插入的片段大小及阅读框架全部正确；从IPTG浓度、诱导表达时间与温度三个方面对蛋白表达条件进行了优化：用NTA.Ni柱纯化融合六个组氨酸的HCV重组抗原(H-C、H-NS3和H-NS4)，用Glutathione Sepharose柱子纯化融合GST的重组抗原(G-C、G-NS3和G-NS4).最后经SDS-PAGE鉴定，纯化到的六种HCV重组抗原纯度均较高，经蛋白定量测定后浓度分别为：H-C为1.35mg/ml(尿素变性)；G-C为0.812mg/ml；H-NS3为1.14mg/ml；G-NS3为1.31mg/ml；H-NS4为3.28mg/ml(尿素变性)；G-NS4为1.62mg/ml。
二、HCV抗原的HRP标记以及HCV抗体双抗原夹心ELISA的建立与评价：
采用改良过碘酸钠法，标记了三种HCV重组抗原(G-C、G-NS3和G-NS4)。使用已知抗-HCV阳性混合血清和阴性混合血清，从包被抗原、酶标记抗原二个方面进行方阵滴定，建立了单片段抗原夹心ELISA。方阵滴定结果显示，抗-HCV的C抗体检测时，包被抗原H-C的浓度为30μg/ml，酶标抗原G-C稀释度为1:3000；抗-HCV的NS4抗体检测时，包被抗原H-NS4浓度为30 μg/ml，酶标抗原G-NS4稀释度为1:1000；抗-HCV的NS3抗体检测时，包被抗原H-NS3浓度为30 μg/ml，酶标抗原G-NS3稀释度为1:1000。单片段夹心ELISA方阵滴定结果，可以得出的结论是酶标抗原G-C的工作稀释度分别是G-NS3、G-NS4的三倍，而G-NS3、G-NS4工作稀释度相同。
用己知抗-HCV阳性混合血清和阴性混合血清lOOul/孔；抗原H-C、H-NS3、H-NS4按摩尔比1:1:0.5的比例混合用作包被抗原；标记后的抗原混合比例与包被抗原的混合比例相对应，按1:3:1.5(根据单片段抗原夹心ELISA方阵滴定结果求得)混合作第二抗原，重新方阵滴定，建立了双抗原夹心ELISA。方阵滴定结果显示，混合包被抗原工作浓度为50μg/ml，混合酶标抗原的工作稀释度为1:200。同时，分别从包被缓冲液、聚苯乙烯微孔板、封闭液、酶标抗原稀释液、标本稀释度等方面，优化了实验条件。
用间接ELISA(万泰试剂)与双抗原夹心ELISA，同时检测了收集自南京市第二人民医院检验科的1968份血清标本，其中有17份血清标本在两种检测方法中检测结果不相符，又用HCV RNA套式RT-PCR检测了这17份血清标本，发现14份间接法抗体阳性而双抗原夹心法阴性的血清标本中只有1份标本的HCV RNA阳性，3份间接法阴性而夹心法阳性的血清标本中有2份标本的HCV RNA阳性。双抗原夹心法与间接ELISA法总体符合率为99.1％；以两种ELISA检测抗-HCV均阳性为HCV真阳性，而以两种ELISA检测抗-HCV均阴性为真阴性，再结合套式RT-PCR的结果，可以得出：来自二院的这1968份血清标本中，HCV的感染率为9.8％(193P1968)；本实验所建立的双抗原夹心法ELISA与间接法ELISA(北京万泰)的敏感性分别为99.4％和98.9％；特异性分别为99.9％和99.2％。
此外，用套式RT-PCR检测了31份间接法与夹心ELISA法抗-HCV均阳性的血清标本，发现有23份血清HCV RNA阳性，HCV RNA阳性率为74.2％(23/31)，远远高于14份间接法抗体阳性而双抗原夹心法阴性的血清标本的阳性率7.1％(1/14)。提示间接法检测抗-HCV IgG可能存在一定比例的假阳性。
综上所述，我们建立的检测HCV抗体的双抗原夹心法ELISA具有较高的敏感性和特异性，有望用于临床HCV感染的诊断和献血员的筛选。