猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征、母猪繁殖障碍、猪呼吸道综合征、猪皮炎与肾病综合征、先天性震颤和其他圆环病毒相关疾病,对全球养猪业造成巨大损失。疫苗免疫是防控PCV2相关性疫病的主要手段。PCV2分离株存在基因差异,目前PCV2有PCV2a到PCV2e多个亚型。目前商品化的猪圆环疫苗主要是基于PCV2a/b亚型的全病毒灭活疫苗和基于PCV2a亚型的基因工程亚单位疫苗。由于这些疫苗中存在的免疫不相关蛋白可在注射部位产生副反应,病毒灭活过程中导致的抗原决定簇的变化而影响免疫效果。此外,由于圆环病毒在细胞中生长缓慢,全病毒培养获得高滴度病毒难度大,表达的抗原需要浓缩和纯化而导致疫苗的生产成本增加。因此,研制新型PCV2疫苗很有必要。病毒样颗粒(VLPs)由于其表面具有重叠的抗原表位,病毒样的结构和能够诱导体液免疫和细胞免疫而备受疫苗研发的青睐。为此,国内外很多人尝试在不同系统中表达重组的PCV2 Cap蛋白。大多数情况下,Cap蛋白以截断或全长的单体形式被表达。利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达的PCV2 Cap能够自我装配成VLPs,所形成的VLPs在结构和抗原性方面与天然病毒的Cap蛋白没有区别。但由于抗原纯化和浓缩的成本居高不下,导致目前商品化的PCV2 Cap VLPs疫苗价格高昂。因此,研究廉价、高效的基于我国主要流行亚型PCV2b的亚单位疫苗替代进口疫苗势在必行。本研究中,我们证明基于PCV2b的Cap VLPs可以在大肠杆菌中有效表达,而且研究结果显示大肠杆菌来源的PCV2 Cap VLPs可以作为制备PCV2疫苗的有效抗原。本论文研究内容分为以下四个部分:1.PCV2 Cap蛋白VLPs在E.coli中的可溶性表达、鉴定和纯化根据大肠杆菌密码子偏好性,将完整的PCV2 ORF2基因进行密码子优化并合成,克隆入pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-32a-cap。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21宿主菌中并进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析、可溶性鉴定及Westernblot鉴定。结果表明:PCV2 ORF2基因编码的完整Cap蛋白在大肠杆菌中能够可溶性表达,目的蛋白可与猪PCV2多抗发生反应,具有良好的反应原性。透射电镜结果显示Cap蛋白能够形成直径约为17 nm-20 nm的病毒样颗粒,形态结构与PCV2病毒粒子相似。用硫酸铵盐析法对Cap蛋白进行了高效纯化。2.PCV2 Cap蛋白VLPs在小鼠体内的免疫原性研究以纯化的Cap蛋白VLPs作为免疫抗原,以不同剂量抗原与卡波姆水佐剂乳化,制备Cap蛋白VLPs免疫原,免疫SPF级昆明鼠,同时设立商品化Cap VLPs组、全病毒灭活疫苗(LG株)组及佐剂对照组,用间接ELISA方法检测抗体水平,并进行小鼠脾脏T淋巴细胞转化试验。结果显示,自制Cap VLPs免疫组抗体水平高于商品化Cap VLPs组和全病毒灭活疫苗(LG株)组;各组小鼠脾脏淋巴细胞受Cap VLPs刺激后,自制Cap VLPs免疫组小鼠淋巴细胞增殖活性显著高于商品化Cap VLPs组和全病毒灭活疫苗(LG株)组。表明本研究制备的PCV2 Cap蛋白VLPs疫苗在小鼠上具有良好的免疫原性,且诱导的体液免疫和细胞免疫水平均高于商品化Cap VLPs疫苗组和全病毒灭活疫苗(LG株)组,为研究和临床应用PCV2 Cap蛋白VLPs亚单位疫苗奠定了良好的基础。3.PCV2 Cap蛋白VLPs间接ELISA抗体检测方法的建立与应用以纯化的Cap蛋白VLPs作为包被抗原,建立了检测猪抗PCV2抗体的间接ELISA方法。建立的ELISA方法的最佳反应条件是:最适抗原包被量为1μg/孔,包被时间为37℃1h之后4℃过夜;血清作用浓度为1:400,作用时间为1.5 h;二抗稀释度为1:8000,作用时间为1 h;显色液TMB作用时间为15 min;临界值的判定标准为:样品S/P值≥0.2235判为阳性,S/P值<0.1905判为阴性。所建立的ELISA方法具有良好的特异性、重复性及敏感性。选择部分疑似猪PCV2血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒检测之间有很高的符合率。本研究建立的ELISA方法在临床上可用于猪PCV2抗体检测和流行病学调查。4.PCV2 Cap蛋白VLPs疫苗在猪体内的免疫原性研究以Cap蛋白VLPs作为抗原,与卡波姆水佐剂乳化,制备Cap蛋白VLPs疫苗,免疫20日龄PCV2抗原和抗体双阴性健康仔猪,同时设立商品化Cap VLPs组、全病毒灭活疫苗(LG株)组及佐剂对照组,用间接ELISA抗体检测方法检测各组仔猪PCV2抗体水平。结果显示,免疫后自制Cap VLPs免疫组抗体水平高于商品化Cap VLPs组和全病毒灭活疫苗(LG株)组。表明本研究制备的PCV2 Cap蛋白VLPs疫苗具有良好的免疫原性,为后续PCV2 Cap蛋白VLPs亚单位疫苗的研发和临床应用奠定了良好的基础。