子痫前期是特发于人类的妊娠期多系统综合征，在全球范围内的发病率约为5％-10％；其临床表现主要为妊娠20周以后突然发生的高血压和蛋白尿等症状，并伴随有多脏器的损伤，是目前产科临床导致孕产妇和围产儿死亡的重要原因之一。其病因研究有很多，目前广为接受的学说是胎盘发育障碍学说，即滋养层细胞对母体子宫内膜侵润不足和对母体螺旋动脉改建不完全，导致胎盘血流灌注减少，功能不完全，进而胎盘释放一些因子进入母体血液循环，造成母体多种脏器损伤，最终导致子痫症状的产生。　　肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)是一种多能性的生长因子，在细胞增殖、迁移和形态发生方面具有重要的作用，主要是由纤维细胞和一些间叶细胞产生。HGF基因敲除小鼠胎盘发育过程中迷路滋养层细胞大量减少，小鼠在出生前死亡，说明HGF在胎盘发育过程中具有重要的作用。HGF的受体c-MET是一种具有胞内酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，由α和β两种亚基组成异二聚体。HGF与其结合后会激活胞内的酪氨酸激酶活性，进一步激活其下游的MAPK、PI-3K等信号通路，而调控细胞的增殖、迁移和管形成等行为。研究表明在人的外周血中存在可溶性形式的c-MET(即sMet)，由c-Met经蛋白质剪切形成；生化分析表明sMet可以竞争性结合HGF，有可能阻断HGF/c-MET信号通路。人动脉平滑肌细胞中的研究显示HGF能够促进sMet的产生。在人胎盘中，HGF主要由合体滋养层细胞、绒毛外滋养层细胞、血管内皮细胞和绒毛间质细胞产生，c-MET则主要定位于各种滋养层细胞，因而HGF可能通过旁分泌途径参与调节滋养层细胞功能。　　有关c-Met剪切形成sMet的机制尚未得到充分的阐明。但有证据提示金属蛋白酶活性对这一剪切过程很重要。去整合素金属蛋白酶家族ADAM(AdisintegrinandMetalloproteinases)属于锌蛋白酶超家族，该家族成员的主要功能是介导蛋白质与蛋白质相互作用，并能将许多细胞因子、生长因子、受体等进行蛋白质水解，使其功能段脱落。ADAM家族分子对于调节细胞增殖、分化、黏附、迁移、融合等都起着重要作用，并与人类肿瘤、哮喘、炎症反应、子痫前期等疾病的发生发展直接相关。在众多的ADAM家族成员中，ADAM10和ADAM17对TNF-α、NOTCH、E-cadherin、proHB-EGF、EGFR、erbB4、NGFR和L-selectin的剪切已有很多报道，近年来也有证据提示ADAM10有可能参与切割c-MET的剪切。　　基于上述事实，我们提出假设：人类胎盘中ADAM10和ADAM17可能剪切HGF受体c-Met形成sMet，由此对HGF在胎盘中的功能进行调控。为证实这一假设，本研究首先对c-Met、ADAM10和ADAM17在人胎盘中的定位进行了细致分析，并明确了它们以及sMet在子痫前期胎盘和正常妊娠胎盘中的表达差异；进而利用体外培养的人类滋养层细胞系(B6Tert-1)和脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)为模型，研究sMet对HGF/c-Met信号通路和功能的影响，探讨ADAM10和ADAM17是否为c-Met的剪切酶，进一步阐释了HGF在c-Met剪切过程中的作用。研究结果如下：　　免疫荧光结果显示在人胎盘绒毛组织中，c-MET主要定位于细胞滋养层细胞、合体滋养层细胞和绒毛内血管内皮细胞，在这些部位与ADAM10和ADAM17都有共定位。与正常妊娠胎盘相比，重症子痫前期胎盘中c-MET的表达水平没有显著变化，但是sMet以及ADAM10和ADAM17的表达量均显著升高，同时它们的定位都没有发生改变。这为我们进一步研究ADAM10和ADAM17剪切c-Met的机制提供了生理学和病理学的基础。　　利用体外培养的B6Tert-1细胞系和原代HUVEC细胞，我们证实HGF可激活AKT和MAPK信号通路，进而促进滋养层细胞的浸润能力和血管内皮细胞的成管；sMet可以抑制HGF对AKT和MAPK信号的激活，阻碍HGF的上述功能。结果显示，B6Tert-1细胞和HUVEC细胞均可产生一定量的sMet，基质金属蛋白酶的广谱抑制剂GM6001能够显著减少细胞产生的sMet；进一步利用不同的抑制剂发现仅有ADAM10和ADAM17的特异性抑制剂能够显著降低细胞产生sMet。在B6Tert-1细胞中转染ADAM10和ADAM17的特异性siRNA干扰序列后，ADAM10和ADAM17表达下降，在c-Met表达不变的情况下，细胞产生的sMet显著降低；而ADAM家族另一成员ADAM12特异性敲低并不影响c-Met的剪切。随后，我们构建了金属蛋白酶区域突变的ADAM10或ADAM17质粒，金属蛋白酶区域突变会导致酶切活性降低。突变质粒转染293T细胞后发现细胞产生sMet的能力大大下降，并且这一抑制作用随转染突变质粒数量的增加而越来越显著。上述一系列的结果证实在人类滋养层细胞和血管内皮细胞中，ADAM10和ADAM17可通过其金属蛋白酶活性剪切c-MET形成sMet。　　我们在B6Tert-1细胞中发现HGF对其受体c-MET的表达具有剂量依赖性，同时可显著促进ADAM10和ADAM17的表达；相应地，sMet/c-MET的相对量也显著增加。外加ADAM10或ADAM17的特异性抑制剂能够阻断HGF对ADAM10和ADAM17的上调以及对sMet/c-MET水平的影响。这些结果表明HGF可通过影响受体c-Met的表达和剪切进行功能的自我调节。　　子痫前期妊娠过程中，子宫-胎盘血液循环不足会导致胎盘局部缺氧和过度的氧化应激。我们以H2O2或抗氧化物抑制剂DDC处理B6Tert-1细胞，在体外模拟滋养层细胞的氧化应激状态，发现细胞中ADAM10和ADAM17的水平有所增加，同时所产生的sMet水平显著增高。这一结果提示氧化应激状态可能直接增强HGF受体c-Met的剪切。　　综上所述，本研究的结果表明，在人胎盘滋养层细胞和血管内皮细胞中，HGF下调自身受体c-Met的表达、并上调c-Met的剪切酶ADAM10和ADAM17以促进自身受体剪切为具有拮抗作用的sMet，从而实现对其功能的自我负反馈调节。ROS刺激可能通过增强ADAM10和ADAM17的活性导致c-Met的过度剪切，破坏HGF反馈调节的稳态，引起子痫前期相关的胎盘功能缺陷。　　本论文的第二部分是研究印记基因H19在小鼠胎盘发育中的作用。鉴于经典的H19基因敲除小鼠均伴有Igf2表达上调，难以阐明H19基因自身对胎盘发育的影响，我们利用慢病毒介导的胎盘特异基因敲降手段，在囊胚期特异降调滋养外胚层细胞中H19基因的表达，通过胚胎移植构建了胎盘H19特异性降低而胎儿H19表达正常的小鼠模型；这些小鼠可成功发育到期，与对照组相比较，胎盘中Igf2的的表达水平未发生改变，胎盘重和胎儿重均无明显变化。目前对胎盘发育过程的分析仍在进行中。