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由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)一直严重的影响着猪养殖场的经济和猪养殖业的发展。PRRS较难防控,于是人们将抗病育种研究作为防控的关键手段。早在20世纪50年代,研究者经过数多代的选择性育种,培育出抗猪丹毒品种猪。目前,华中农业大学刘榜教授通过以通城猪为母本,大白猪为父本培育出新品种即鄂通两头乌猪,不仅具有肉质好、口感好的优点而且也同时保存通城猪抗PRRSV的特点。有关PRRSV的研究热度一直不断,但大多是关于PRRSV引起机体炎症的致病机制和品种差异的研究,PRRSV导致组织微血栓形成的原因,却少有研究。本研究以鄂通两头乌猪为研究对象,运用组织病理学技术、电子显微镜技术观察PRRSV感染鄂通两头乌猪肺组织的病理变化特征,并围绕病理变化的特点,运用免疫组化、荧光定量PCR和Western blot技术,观察PRRSV、TNF-α、eNOS和组织因子(TF)的分布和变化规律,从而阐述鄂通两头乌猪感染PRRSV的病变特征及发病机制,不仅为PRRSV抗病育种积累病理学研究资料而且也丰富PRRSV的致病机制研究内容。本研究主要包括以下内容:1 PRRSV感染鄂通两头乌猪的临床症状和肺组织大体病理变化观察鄂通两头乌猪感染三天后持续出现高烧症状,体温>40℃,精神状态萎靡,食欲明显减退,喜卧,反应迟钝,呼吸困难。感染六天后部分猪出现皮肤发绀及神经症状,表现为抽搐,肌肉震颤,后肢轻微瘫痪。正常对照组精神状态良好,食欲正常,维持正常体温38.5～39.5℃。剖检后观察感染猪肺脏,发现因严重的淤血,肺脏呈暗红色;肺尖叶、心叶、隔叶后缘质地变实,颜色暗红,重量增加;部分感染猪肺脏出现水肿,体积增大,被膜紧张而有光泽,严重水肿猪在肺背缘出现明显的肋骨压痕;大多数感染猪肺脏出现不同程度的间质增宽。正常对照组猪肺脏未见异常。研究结果表明,PRRSV对肺脏造成严重的损害,降低肺脏的呼吸功能,使感染猪因呼吸困难导致身体末梢供氧不足。2 PRRSV感染鄂通两头乌猪的肺组织病理学变化观察与正常对照组相比,感染猪肺泡间隔出现不同程度的增宽;肺泡壁毛细血管扩张,官腔内聚集大量红细胞;部分气管和支气管腔内含有大量脱落的上皮细胞和巨噬细胞;少数感染猪的肺泡腔内充满渗出液并混有少量巨噬细胞;肺泡腔内有大量脱落的肺泡上皮细胞、淋巴细胞及巨噬细胞;部分支气管周围有大量淋巴细胞围绕;肺泡壁有大量微血栓;少数感染猪肺泡壁塌陷;肺泡腔内有大量的坏死细胞。研究结果表明PRRSV导致感染猪出现不同程度的间质性肺炎,并且此次研究发现肺泡壁毛细血管有不同程度的微血栓形成,表明PRRSV能够对血管造成损伤,形成微血栓。3 PRRSV感染鄂通两头乌猪肺组织微血栓病变与病毒、死亡率的关系通过对46头感染猪进行肺组织微血栓病理变化观察,根据微血栓病变评分标准进行评分,22头感染猪为轻度微血栓,14头感染猪为中度微血栓,10头感染猪为重度微血栓。通过将微血栓病变程度与死亡率进行分析,发现重度微血栓组死亡率高于轻度和中度微血栓组,表明肺组织大量微血栓形成可能是导致PRRS高死亡率的原因之一。4 PRRSV、TNF-α、eNOS和TF在感染鄂通两头乌猪肺组织中的分布及表达免疫组化技术实验结果发现,正常肺组织不表达PRRSV,感染猪肺组织PRRSV主要分布于肺泡巨噬细胞、少量淋巴细胞。随后我们分析肺组织轻度、中度和重度微血栓PRRSV的表达,发现轻度微血栓组、中度微血栓组和重度微血栓组呈阶梯式增长,重度微血栓组PRRSV的表达显著高于轻度和中度微血栓组。研究结果表明PRRSV参与微血栓形成的过程,增加感染猪死亡率。利用免疫组化技术、荧光定量PCR和Western blot技术检测TNF-αm RNA和蛋白水平的表达和分布,发现正常肺组织出现极少量的TNF-α特异性阳性反应产物。与正常对照猪相比,感染猪肺组织TNF-α抗原阳信信号染色及数量增多。TNF-α抗原阳信信号主要分布于肺泡巨噬细胞及淋巴细胞。通过分析肺组织轻度、中度和重度微血栓TNF-α的表达,发现随着TNF-α表达的升高,微血栓病变严重程度逐渐加重,重度微血栓组TNF-α的表达显著高于轻度微血栓组和中度微血栓组。研究结果表明,感染猪肺组织通过上调TNF-α表达,参与微血栓形成过程并对微血栓形成有促进作用。本研究利用免疫组化技术、荧光定量PCR和Western blot技术检测eNOS m RNA和蛋白水平的表达和分布规律,发现eNOS主要分布于肺泡Ⅱ型细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞及支气管平滑肌细胞。与正常肺组织相比,感染组阳性信号染色及数量显著低于正常对照组。研究结果表明,感染猪通过下调肺组织eNOS的表达,参与感染猪肺组织微血栓的形成。TF免疫组化结果显示:TF主要分布于肺泡巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞及血浆,呈棕黄色。与正常对照组相比,感染组阳性信号染色及数量显著高于正常对照组,阳性率结果分析发现,轻度微血栓组、中度微血栓组和重度微血栓组呈梯度上升趋势。研究结果表明,TF启动外源性凝血系统,改变血液状态,参与微血栓形成的过程。以上结果表明,PRRSV感染鄂通两头乌猪肺组织病理变化主要表现为间质性肺炎,除此之外,肺脏的毛细血管出现大量微血栓。PRRSV、TNF-α、eNOS和TF的表达与肺脏微血栓病变严重程度有密切的关系而且肺脏微血栓形成增加了PRRSV感染猪死亡率。