白木香茉莉酸类物质合成途径关键酶AOS1基因的克隆与表达研究

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白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)植物,是我国国产沉香唯一植物资源,具有极高的药用价值和经济价值。茉莉酸及其衍生物作为植物伤害信号分子影响植物次生代谢途径中许多关键酶基因的协调表达,并可以作为外源诱导子对植物次生代谢物进行调控,可诱导沉香特征性成分的生成。丙二烯氧化物合成酶AOS是茉莉酸生物合成途径关键酶之一,但有关茉莉酸类物质(JAs)合成途径基因的功能和基因的诱导表达还不十分明确。深入探索茉莉酸生物合成途径与植物次生代谢产物的关系,以达到利用基因工程调控沉香特征性成分的产生,将具有十分重要的理论和实际应用价值。本研究以白木香为实验材料,利用GC-MS分析MonoTrap法萃取的茉莉酸甲酯处理后的白木香愈伤组织的挥发性成分;并从白木香中克隆了JAs合成途径关键酶基因AOS1,利用Real-time PCR研究其表达特性,构建了植物表达载体pXCS-AsAOS1,转化模式植物拟南芥,为进一步研究白木香茉莉酸生物合成途径与沉香形成的分子机制奠定了基础。主要结果如下:1)利用正交实验法优化MonoTrap萃取白木香愈伤组织挥发性物质的条件并对其萃取物进行GC-MS分析。正交实验分析结果表明,最佳萃取条件是当不破碎愈伤组织材料,于30℃条件下、采用MonoTrap捕集6h时效果最佳。GC-MS分析结果表明,MeJA诱导的白木香愈伤组织产生了α-愈创木烯、α-葎草烯、β-榄香烯和δ-愈创木烯4种倍半萜。2)通过RT-PCR获得了白木香AsAOS1(1575bp)的基因全长,并对其基因序列进行生物信息学分析,结果表明其与其它物种均有较高的同源性。并利用软件对其性质进行分析预测,发现其含有一个叶绿体转运肽,属于细胞色素P450大家族。3)通过白木香GAPDH内参基因的保守序列,设计特异性引物,利用RACE技术扩增其3’端和5’端基因片段,经过DNAMAN软件拼接,获得GAPDH (1299bp)的全长。对其进行生物信息学分析,结果验证了GAPDH基因序列的正确性及高度保守性,可作为Real-time PCR的内参基因。4)通过RT-QPCR对白木香茉莉酸生物合成途径关键酶基因AsAOS1、倍半萜生物合成途径关键酶基因DXPS、HMGR、FPS及ASS1的表达情况进行分析。实验结果表明,AsAOS1、DXPS、HMGR、FPS及ASS1基因在不同组织中均有表达,在MeJA诱导下表达量均出现上调。其中,AsAOS1和HMGR基因在新叶中表达量最高;DXPS和FPS基因在根中表达量最高;ASS1基因在茎中表达量最高,茎中的表达量为根的48.87倍。输液法诱导条件下,AsAOS1基因的表达水平在48h相对表达量达到最高;喷雾法诱导处理下,AsAOS1基因的表达水平在24h相对表达量达到最高,之后趋于稳定。喷雾法诱导处理对DXPS基因和ASS1基因的促进作用有显著性差异;HMGR和FPS基因表达量变化差异不明显。DXPS和ASS1的相对表达量在诱导24时达到最大,分别为对照的4.04倍和12.53倍。5)构建了植物表达载体pXCS-AsAOS1,通过农杆菌介导,采用喷雾法转化拟南芥,经过Basta除草剂筛选T1代,获得转基因拟南芥幼苗。通过PCR检测,初步筛选出转基因拟南芥。为进一步研究丙二烯氧化酶转基因植株奠定实验基础。
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