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病毒感染、杀死和裂解浮游植物是海洋生态系统中的普遍现象,且病毒感染是导致浮游植物自然死亡的主要因素之一。在海洋生态系统中,病毒控制着浮游植物群落的丰度和结构,并对赤潮的生消起着调控作用。一个可能的假设就是藻类病毒可以用于阻止或终止有害藻赤潮的形成。但对这些作用的详细过程及其调节机制的了解尚十分有限,特别是在病毒与藻类宿主相互作用关系方面的研究则刚刚起步。本文以海洋赤潮微藻球石藻Emiliania huxleyi和非赤潮藻金色刺球藻Chrysochromulina ericina为研究对象,在室内纯培养条件下,建立病毒与宿主稳定的感染体系。采用分子细胞生物学及蛋白质组研究等技术,就海洋微藻类病毒与宿主之间相互作用的分子机制进行了初步探讨,主要研究内容和结论如下：
⑴通过蛋白免疫印迹技术,研究了病毒感染对海洋球石藻E.huxleyi和刺球金色藻C.ericina细胞周期G2/M监控点调控蛋白表达的影响,分析该两种微藻类病毒感染对其宿主细胞周期进程的调控模式。结果显示,球石藻病毒(EhV-9981)感染宿主细胞后,通过诱导p34Cdc2激酶的磷酸化而抑制了p34Cdc2/cyclinB复合物的活性,最终将宿主细胞周期阻止在G2/M监控点。对p34Cde2激酶活性分别起正负调控作用的Cdc25C磷酸酯酶去磷酸化失活和Weel激酶高水平表达的共同作用则可能是抑制p34Cdc2活性的主要原因;而刺球金色藻被病毒(CeV-01B)感染后,活性形式的p34Cde2激酶表达水平急剧增加,但由于伴随着cyelinB表达的明显降低和过早的磷酸化,致使p34Cdc2/cyclinB复合物的活性降低,并最终导致宿主细胞周期G2期的延长。磷酸化活性形式Cde25C的高表达结合Weel的磷酸化失活可能是激活p34Cdc2并促使其高表达的主要机制。EhV感染导致细胞周期终止在G2/M,表明EhV基因的复制和转录可能不依赖于宿主细胞周期的运行;而CeV感染后出现G2期的延长则可能导致部分宿主细胞进入下一个S期,为CeV的核酸代谢提供更多所需蛋白,因此推测CeV的复制和转录可能依赖于宿主细胞周期。微藻类病毒基因表达依赖或不依赖于宿主细胞周期将可能对藻类病毒感染与宿主细胞周期进程之间的相互作用具有潜在的意义,可能也正是由于这种相互作用机制的不同最终决定了宿主藻在自然海域中的丰度。本研究结果提示,微藻类病毒感染通过对宿主特定细胞周期调控因子的选择性激活或抑制以利于病毒基因的有效复制和表达。
⑵采用多种细胞凋亡检测技术分析了病毒感染诱导海洋球石藻E.huxleyi细胞凋亡的形态学及生化代谢特征。球石藻E.huxleyi在病毒感染后出现了典型的凋亡形态学特征,如细胞核固缩、细胞质的收缩及空泡化、细胞核的消失和凋亡小体的形成等;在病毒感染的宿主细胞中检测到凋亡特征蛋白酶caspase-3的活性表达形式并首次在病毒感染的藻类宿主细胞中检测到高表达的磷酸化形式procaspase-3。该研究结果提示:在自然海域中,细胞程序性死亡可能是部分微藻类病毒感染、裂解并导致宿主死亡的途径之一,而病毒对宿主细胞周期的不同调控方式则可能是导致宿主细胞启动或抑制凋亡程序的直接原因。另外,病毒感染诱导的浮游植物细胞凋亡可能存在与高等动植物类似的Caspase蛋白酶参与的凋亡信号途径。
⑶利用生物信息学方法比较分析了海洋球石藻E.huxleyi(CCMP1516)与GenBank中已报道的其他物种的细胞凋亡特征蛋白酶metacaspases(EhMC)基因间的进化关系并对该蛋白的主要理化性质及其二、三级结构等进行了分析预测。结果表明,球石藻EhMC与基因库中已报道的其它原核和真核物种的metacaspases蛋白的同源性较低,大约在31～39％;EhMC序列包含338个氨基酸残基,其中带负电荷的氨基酸残基43个,带正电荷的氨基酸残基35个,预测的相对分子量为36.8kDa,理论等电点为5.19;EhMC的N末端蛋白结构域具有Metacaspase保守的组氨酸-半胱氨酸活性位点氨基酸基序,该酶在其N端没有明显的内质网合成蛋白的信号序列,表明该酶是在胞质游离核糖体上合成,属于胞质蛋白;对该蛋白酶二、三级结构分析预测结果进一步证实EhMC是caspases超家族成员之一。
⑷为了能从蛋白质水平认识海洋病毒与宿主之间的相互作用关系,我们采用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对EhV感染的宿主细胞蛋白质进行了差异蛋白质组学研究。经优化条件,获得了病毒感染和对照组总蛋白分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,并用PDQuest v8.0.1软件对得到的凝胶图像进行了分析。结果表明:50μg球石藻蛋白经双向电泳及银染后在每块凝胶上平均可以检测出220个蛋白点,这些蛋白点的分子量主要集中在10～70kD,等电点处于pH4-7之间。其中大约30％的蛋白表达量及分布情况基本相同;感染的早、中、晚期分别有11、14及10个蛋白出现了表达量的上调,18、11及11个蛋白出现了表达量的下调;感染后超过50％的蛋白在表达图谱上新出现或消失。对其中8个表达量差异显著的蛋白进行了MALDI-TOF-MS鉴定,根据其肽质量指纹图谱进行数据库查询。其中1个感染后表达上调的蛋白被成功鉴定为类酰基磷酸酯酶蛋白,功能预测发现其对凋亡抑制途径具有负调控作用,这一结果也间接证实了EhV感染能够诱导宿主细胞凋亡这一现象。海洋球石藻E.huxley病毒感染的宿主细胞比较蛋白质组学研究结果为进一步探索该藻对病毒感染的总体反应机制奠定了基础。