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研究背景交感神经系统-β肾上腺素能受体(β-adrenoceptor,β-AR)激活是心肌损伤和心力衰竭的重要病理生理机制之一。β-AR激活可通过提高心肌收缩功能和心率起到功能代偿作用;然而,病理情况下长期、过度的β-AR活化则可导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。目前对β-AR过度活化诱导心肌损伤机制的了解还十分有限。近几年研究者们开始关注Hippo信号通路在心肌损伤和心力衰竭中的作用,但具体机制目前仍不清楚。Hippo通路是调节细胞凋亡和增殖的重要信号途径之一,其主要成员包括哺乳动物不育系20-样激酶1/2(mammalian sterile 20-like kinase 1/2,Mst1/2)、大肿瘤抑制因子同源物1/2(large tumour suppressor homolog 1/2,Lats1/2)、转录共调节因子Yes-相关蛋白(yes-associated protein,YAP)以及YAP的平行同源因子TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,具有PDZ结合基序的转录共激活因子)。Hippo信号通路的激活可引起Mst1表达和磷酸化水平增加,通过促进YAP/TAZ磷酸化,抑制下游细胞增殖相关基因表达,同时促进细胞凋亡相关基因的表达。最近研究发现,心肌梗死时,抑制Hippo信号通路具有心脏保护作用。但目前尚不清楚心脏β-AR过度活化是否可通过激活Hippo信号通路导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。本人博士联合培养指导老师,澳大利亚Baker心脏和糖尿病研究所杜晓军教授课题组前期研究发现,在β-AR激动剂异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)诱导的小鼠心肌损伤模型和心肌细胞特异性β2-AR过表达小鼠心肌组织中,促凋亡蛋白Bcl-2相互作用的细胞死亡介导因子(Bcl-2 interacting mediator of cell death,BIM)和促纤维化蛋白半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)的表达均升高。BIM是Bcl-2家族中仅含一个BH3结构域的小分子促凋亡蛋白。作为细胞凋亡的上游启动蛋白,BIM能够激活促凋亡的Bcl-2家族蛋白(如Bax,Bak)表达,同时下调抗凋亡的Bcl-2家族蛋白(如Bcl-2,Mcl-1)表达。Gal-3是一种与细胞内外糖蛋白有高亲和力的半乳糖凝集素,具有促进组织纤维化和炎症反应的作用。既往研究发现,敲除BIM基因能够抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡、心肌肥大和心功能异常,但Gal-3是否介导了ISO诱导的心肌纤维化和心功能异常目前仍不清楚。此外,目前对于β-AR活化调控心肌细胞中BIM和Gal-3表达的信号转导机制仍不明确。既往研究发现,心肌细胞特异性Mst1过表达小鼠的心肌细胞中Gal-3的表达升高了约40-50倍,提示Mst1-Hippo信号通路可能参与了Gal-3的表达调控。因此,我们推测:β-AR过度活化可激活心肌细胞Hippo信号通路,进而上调BIM和Gal-3的表达,导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。研究方法1.以C57BL/6J小鼠和心肌细胞特异性β2受体转基因小鼠(β2-TG)作为研究对象,其中C57BL/6J小鼠给予不同剂量和不同时间的ISO治疗,采用Western-Blot检测心肌组织中Mst1,YAP,磷酸化YAP(p-YAP)和BIM的表达水平,ELISA检测Gal-3表达,并检测β-AR阻滞剂对YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达的影响。2.以Gal-3基因敲除(Gal-3 KO)小鼠作为研究对象,并给予ISO治疗,心脏超声检测小鼠心功能,羟脯氨酸浓度测定法检测小鼠心肌组织胶原含量,ELISA检测心肌组织中Gal-3水平,RT-q PCR检测心肌纤维化和炎症相关基因,以及心肌组织中YAP靶基因(CTGF、Ankrd1和Birc5)的表达水平。3.以心肌细胞特异性Mst1转基因小鼠(Mst1-TG)和Mst1显性失活突变体转基因小鼠(dn Mst1-TG)作为研究对象,并给予ISO治疗,Western-Blot检测心肌组织中YAP,p-YAP和BIM的表达,ELISA检测心肌组织中Gal-3水平;采用生物信息学方法分析Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP靶基因的表达,并采用RT-q PCR检测Gal-3敲除对YAP靶基因的调控作用。4.体外培养H9c2细胞(大鼠心肌细胞株),并给予si RNA-YAP治疗,Western-Blot检测YAP、BIM和Gal-3的表达水平,明确YAP敲低对心肌细胞中BIM和Gal-3蛋白表达的影响;H9c2细胞分别给予ISO、PKA抑制剂H89或PKI 14-22、腺苷酸环化酶激活剂Forskolin治疗,研究c AMP/PKA信号转导对ISO诱导的YAP磷酸化以及BIM、Gal-3表达的影响。研究结果1.ISO通过上调心肌组织中BIM和Gal-3表达诱导心肌损伤1)ISO能够时间和剂量依赖性的上调C57BL/6J小鼠心肌组织中BIM和Gal-3表达;2)非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔或卡维地洛能够显著抑制ISO诱导的小鼠心肌组织中BIM和Gal-3表达;选择性β1-AR阻滞剂阿替洛尔(AT)和β2-AR阻滞剂ICI-118551(ICI)也可有效抑制ISO诱导的Gal-3表达,当联合使用AT和ICI时,Gal-3表达有进一步降低的趋势;3)β2-TG小鼠心肌组织中BIM和Gal-3水平均显著上调,其中Gal-3的表达呈年龄依赖性增加;4)正常野生型小鼠给予ISO治疗后,心肌组织中Gal-3水平显著增加,左室短轴缩短率降低40%,心肌胶原含量升高55%,纤维化和炎症相关因子m RNA水平均上调。敲除Gal-3基因后,左室短轴缩短率回升,心肌胶原含量降低,纤维化和炎症相关因子m RNA水平降低。2.ISO可激活小鼠Hippo信号通路,促进心肌组织中Mst1表达和YAP磷酸化1)ISO能够上调C57BL/6J小鼠心肌组织中Mst1,YAP和YAP Ser127位点的磷酸化水平;2)非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔和卡维地洛能够显著抑制ISO诱导的小鼠心肌组织中YAP的表达和磷酸化水平;3)ISO可同时上调心肌细胞核YAP(n YAP)与细胞浆YAP(c YAP)表达,其中细胞浆YAP蛋白(c YAP)的增加更明显,n YAP与c YAP的比值(n YAP/c YAP)显著降低;4)β2-TG小鼠心肌组织中Mst1表达和YAP磷酸化水平呈年龄依赖性增加。3.ISO通过激活Hippo信号通路促进BIM和Gal-3表达1)Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达均显著增加,给予ISO治疗后,Gal-3表达进一步增加;2)Mst1失活突变(dn Mst1-TG)后,ISO诱导的心肌组织中YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达均显著抑制;3)生物信息学分析发现Mst1-TG小鼠心肌组织中存在8,619个差异表达基因,其中4,080个基因上调,4,539个基因下调。比对Cistrome DB中已发表的YAP Ch IP-seq数据,Mst1-TG小鼠心肌组织中共发现666个YAP靶基因,其中262个上调,179个下调。基因集富集分析结果表明Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP靶基因集上调;4)降低H9c2细胞(大鼠心肌细胞株)中的YAP水平,可显著上调BIM和Gal-3表达;5)ISO治疗或心肌细胞特异性Mst1过表达(Mst1-TG)均可上调小鼠心肌组织中三种YAP靶基因(CTGF、Ankrd1和Birc5)的表达。Gal-3基因敲除可显著抑制ISO诱导的YAP靶基因表达;在Mst1-TG背景下敲除Gal-3后,Birc5表达无明显改变,而CTGF和Ankrd1却显著下调。4.ISO通过c AMP/PKA激活Hippo通路,促进BIM和Gal-3表达1)PKA抑制剂H89和PKI 14-22均可显著抑制ISO诱导的H9c2细胞中p-YAP,BIM和Gal-3的表达;2)腺苷酸环化酶激活剂Forskolin可显著上调H9c2细胞中Mst1,p-YAP,BIM和Gal-3的表达水平。研究结论心肌β肾上腺素能受体过度活化可通过c AMP/PKA信号转导激活Hippo通路,诱导Mst1表达和YAP磷酸化,通过上调BIM和Gal-3表达,促进心肌细胞凋亡和心肌纤维化。本研究首次揭示β-AR可与Hippo信号通路相偶联,并通过调节下游的促凋亡蛋白BIM和促纤维化蛋白Gal-3表达,最终导致心肌损伤和心功能异常。本研究提示β-AR/Hippo/BIM-Gal-3信号通路可能成为心肌损伤防治的新靶点。