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大白菜黑芝麻斑点病是大白菜的一种生理性病害。近年来,其发生呈现越来越重的态势,严重降低了大白菜的品质和商品性,已成为制约大白菜出口的重要因素。针对引起黑芝麻斑点病发生的原因尚不完全清楚的问题,本研究采用cDNA-AFLP技术,分析抗感品系在发病条件(高氮)和不发病或少发病条件(低氮)下基因表达的差异,对相关差异片段进行克隆测序分析,为大白菜黑芝麻斑点病的发病机理研究奠定基础。并通过构建抗×感杂交一代的DH群体,利用AFLP技术构建大白菜分子遗传图谱,旨在为大白菜抗黑芝麻斑点病的遗传育种和相关QTL定位提供理论依据。主要研究结果如下:
(1)大白菜cDNA-AFLP技术体系的优化
采用大白菜黑芝麻斑点病高抗品系‘C24’和高感品系‘(0)3B9’为材料,对cDNA-AFLP体系进行优化的试验结果表明:试剂盒法提取的RNA较完整,纯度较高;400ng的cDNA利用FastDigest(@) EcoRⅠ和FastDigest(@)MseⅠ进行快速双酶切50min,酶切充分;在20μl的体系中,连接产物取原液作为预扩增反应的模板,并且预扩增反应的循环数为35,预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增的模板,扩增结果最佳。
(2)大白菜黑芝麻斑点病相关基因cDNA-AFLP差异表达分析
利用优化后的cDNA-AFLP技术体系,采用64对引物对大白菜黑芝麻斑点病进行分析,筛选到19个与大白菜黑芝麻斑点病相关的差异表达的转录衍生片段(transcript-derived fragments,TDFs)。结果表明:12个TDF与NCBI或Brassica Database已有序列同源,功能涉及激素调节、氧化还原酶、细胞结构、蛋白质分解、信号传导等;3个TDF在NCBI或TIGR找到同源序列,但功能未知;有4个TDF未找到同源序列,可能是一些新基因。结合本课题组有关氮素浓度和形态对大白菜黑芝麻斑点病影响的生理指标的研究结果,推测大白菜黑芝麻斑点病可能是ACC、ABA的调节,蛋白质的降解,细胞膜上细胞信号跨膜转导受阻,细胞结构受到破坏,PPO引起酚类物质褐变共同作用的结果。
(3)通过花药培养和小孢子培养技术获得了大白菜黑芝麻斑点病抗×感杂交一代的102个DH株系,并利用64对AFLP引物组合,获得一张包含150个标记10个连锁群的AFLP连锁图谱,该图谱总长度为1934.7cM,标记间平均图距为12.9cM,偏分离标记的频率为59.3%。