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羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)为十字花科芸薹属植物,属甘蓝种的一个变种,因其叶形美观、叶色丰富,因此也被称为“叶牡丹”。羽衣甘蓝具有较强的耐寒性,在-10℃气温下仍能存活,十分适合在北方地区用作园林绿化植物。但羽衣甘蓝属于典型的异花授粉植物,多表现自交不亲和性(self-incompatibility,SI)。SI是植物防止近亲繁殖和保持遗传多样性的生殖调控手段,但目前对SI的了解仍比较少,已知参与SI信号转导的元件大多具磷酸化蛋白的特性,本试验即通过蛋白质组学与分子生物学结合的方法对可能参与SI的磷酸化蛋白进行筛选,鉴定和分析,并发现了两个未报道过的SI相关候选蛋白,尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)和黑芥子酶结合蛋白(myrosinase bingding protein,MBP),为丰富对SI信号转导的认识提供线索。获得主要结果如下:1.为了寻找SI相关磷酸化蛋白,本试验以羽衣甘蓝自交不亲和系(9#)和自交亲和系(14#)为试材,将9#柱头分别进行亲和与不亲和授粉0 min、15 min、60 min并提取柱头总蛋白,通过λ-磷酸酶与2D-DIGE相结合的方法筛选磷酸化水平差异蛋白,发现其中2个蛋白点与SI呈正相关,9个蛋白点与SI呈负相关,并进行了二级质谱鉴定及生物信息学分析。已知其中UGPase和MBP两个蛋白均参与花粉发育,其功能缺失会导致植物可遗传性雄性不育,因此作为SI候选基因做进一步研究。这些结果为SI相关磷酸化蛋白的研究提供了线索,并为进一步阐释SI信号转导机制奠定了基础。2.为了对SI候选基因进行表达模式的验证与功能分析,首先通过分子克隆手段从羽衣甘蓝9#柱头中获得BoUGPase和BoMBP基因cDNA全长,分别为1465 bp和2797 bp,经生物信息学分析得知其开放阅读框(Open reading frame,ORF)内分别编码476个和931个氨基酸。经Real-Time PCR技术进行表达分析,发现BoUGPase在花药中表达量相对较高,而BoMBP在花柱和子房中的表达量相对较高,均具备SI相关基因的组织表达特性,说明其可能参与SI反应。为了进一步验证其表达模式及磷酸化蛋白特性,同时为单克隆抗体的制备准备抗原,构建了原核表达载体pHis-BoUGPase和pHis-BoMBP,并可在表达菌株BL21(DE3)中成功诱导BoUGPase和BoMBP的表达,分别在约55 KDa和100 KDa处获得高丰度表达条带,为蛋白功能分析奠定了基础。3.为了完成SI候选基因的体内功能分析及验证,首先以带柄子叶为外植体建立了羽衣甘蓝遗传转化体系,确定其最佳分化体系为MS0+6-BA 2mg/L;然后对柱头特异性启动子进行了筛选,将已知芸薹属柱头特异性表达基因ARC1和SLR1的启动子分别转化拟南芥,发现SLR1启动子能特异性驱动下游基因在柱头及雌蕊中的高量表达,而ARC1不能,表明SLR1启动子在整个十字花科植物中的功能更为保守,更适合用于下一步研究,也为实现s1候选基因功能验证和分析奠定了基础。