研究背景脑卒中是一种病死率高、致残率高的脑系统疾病,大约80%的中风是缺血性中风。microRNAs(miRNAs)一类长度约为22个核苷酸的非编码小RNA,近年来大量研究证实其可通过调控靶基因表达在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用的。miRNA作为重要的候选生物标志物,在心血管疾病的发展中起着重要作用,特别是在脑卒中的发生发展中。研究表明miR-146a对多种缺血再灌注(I/R)损伤具有重要的调控作用,然而miR-146a对脑I/R损伤的影响未见报道。本研究将探讨miR-146a对小鼠脑I/R损伤调节作用及潜在分子机制。通过构建小鼠脑I/R损伤模型,采用实时荧光定量PCR,五级评分法,2、3、5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色法,伊文思蓝(EB)染色法,ELISA检测,蛋白免疫印迹等分子生物学及病理学手段进行深入的研究。第一部分目的本研究旨在探讨miR-146a对小鼠脑I/R损伤中的作用。方法将购买于北京维通利华实验动物技术有限公司的健康雄性C57BL/6J小鼠(22-25 g),采用10%的水合氯醛麻醉小鼠,固定,选择小鼠颈部正中线偏右的位置,使用眼科剪剪开大约1 cm的切口,再使用眼科镊子将筋膜、肌肉等逐层进行分离,当看见小鼠右侧颈总动脉时,使用开睑器保证手术视野清楚开阔,将颈总动脉分开。再使用真丝细线将颈总动脉结扎,打活结。再分离小鼠的颈外动脉,在结扎处远心端使用电凝刀将颈外动脉切断;再用动脉夹夹闭颈外动脉,同时使用虹膜剪剪开一小口,将线栓从此口进入,打活结用来固定栓线。再将动脉夹打开,将动脉端拉至与劲内动脉成一条直线水平,缓慢将栓线推进,最终使栓线从颈外动脉进入颈内动脉后上行;直至栓线进入小鼠脑部23 mm左右处停止。在栓线插入后血流切断的时间控制在60 min左右,之后便将栓线迅速取出,在颈外动脉上近分叉口处结扎,取下上述活结,使小鼠脑部血流实现再灌注状态,完成缺血再灌注模型的建立。最后再缝合小鼠脑部的皮肤,使用碘伏消毒伤口,小鼠腹腔内注射1 mL青霉素。假手术组与上述步骤相同,但是不进行缺血模型的建立,最后进行缝合。并将小鼠分组为pro-operation组、sham组、MCAO 6 h组、MCAO 24 h组和MCAO 72 h组。实时荧光定量PCR测定miR-146a表达水平。结果实时荧光定量PCR结果显示,miR-146a在pro-operation组与sham组中的表达无显著差异,然而,与sham组相比,miR-146a在MCAO 6 h组中无显著差异,在MCAO 24 h组和MCAO 72 h组中表达显著上调。结论miR-146a在小鼠脑I/R损伤模型中表达显著上调,miR-146a的表达与小鼠脑I/R损伤密切相关。第二部分目的本研究旨在探讨miR-146a对小鼠脑I/R损伤中的调控机制。方法敲降miR-146a表达,在MCAO手术前24 h,小鼠麻醉并固定在立体定位仪中,将miR-146a抑制剂或对照体内转染试剂注射到麻醉小鼠右侧侧脑室中,以0.2 μL/min的速率用微量注射器注射。并将小鼠分组为sham组、MCAO组、MCAO+NC组和MCAO+miR-146a inhibitor组。实时荧光定量PCR测定miR-146a表达水平,五级评分法评估神经行为损伤,2、3、5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色测定脑梗死体积,伊文思蓝(EB)染色测定血脑屏障损伤程度,酶联免疫试剂盒测定炎症因子水平,蛋白免疫印迹测定IRAK1/NF-κ B通路蛋白表达水平。结果(1)在MCAO模型建立前24 h向小鼠大脑注射miR-146a inhibitor,引起miR-146a表达减低。与假手术组比较,MCAO模型组小鼠出现轻中度的神经功能损伤,敲降miR-146a表达加剧小鼠MCAO模型的神经功能损伤程度,敲降miR-146a表达增加脑I/R损伤引发的脑梗死的体积。此外,脑I/R损伤进一步导致脑水肿。敲降miR-146a表达显著上调了脑I/R损伤引发的EB渗出量。(2)与假手术组相比,MCAO模型组小鼠脑组织中相关炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平显著上升,而且敲降miR-146a表达也会进一步加剧MCAO模型小鼠炎症因子水平的升高。(3)与假手术组相比,MCAO模型组小鼠p-IκBα和胞核NF-κB蛋白表达水平上调,而IκBα和胞质NF-κB蛋白表达水平则下调,敲降miR-146a会进一步促进这些蛋白表达的变化。(4)IRAKI是miR-146a的下游靶基因,与假手术组相比,IRAK1在MCAO模型组中表达上调,敲降miR-146a增加I/R损伤引发的IRAK1 mRNA及蛋白表达水平的升高。结论(1)miR-146a表达下调加剧小鼠脑I/R损伤。(2)降低小鼠脑组织内miR-146a水平可以增强由I/R损伤引起的免疫炎症反应。(3)miR-146a表达下调增强小鼠脑I/R损伤引发的NF-κB通路的活化,增强IRAK1表达水平的升高。论文创新点与国内外现有研究相比,本文的创新点主要体现在以下几个方面:1.脑卒中是成人高致残率及病死率的主要原因之一,有逐年上升趋势,组织型纤溶酶激活剂作为仅有的有效治疗药物,尚未能达到广泛应用。本文证实了 miR-146a可通过促进炎症反应从而导致了小鼠脑缺血再灌注损伤的发生,对深入了解脑组织缺血再灌注损伤有一定理论意义。2.本文通过建立在小鼠的脑缺血再灌注损伤模型,首次证实了 miR-146a在脑缺血再灌注损伤中的作用,证实miR-146a表达的下调是脑缺血再灌注损伤发生的重要因素之一。与临床紧密联系,为未来缺血再灌注损伤的提供新的治疗方向。3.本文证实了 miR-146a inhibitor主要通过调控I/R损伤引发的NF-κB通路的活化,增强IRAK1表达水平,从而加重脑组织缺血再灌注损伤。研究初步证实了 miR-146a与脑缺血再灌注损伤的发病机制,为未来将miR-146a作为脑组织缺血再灌注损伤防治靶点的研究提供理论依据。