作为全球青壮年人群重要的致残原因,脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)一直以来都是神经科学领域研究的重点和难点,也是亟待有效治疗手段的中枢神经系统(central nerves system,CNS)损伤性疾病之一。从脊髓损伤的病理机制来讲,损伤造成的神经传导束断裂-轴突(axon)断裂,大脑与脊髓失去信息联系无疑是导致损伤节段以下感觉运动功能障碍的主要原因之一。因此,如何促进受损神经纤维的轴突再生(axon regeneration),恢复脑-脊髓之间的信息联系是治疗脊髓损伤的重要突破口。研究表明,轴突再生主要受到以下两方面因素的影响:(1)损伤局部的抑制性微环境,如髓鞘相关抑制因子(Myelin-associated inhibitors,MAIs),硫酸软骨素蛋白多糖(Chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs),胶质瘢痕(glia scar)等。(2)减弱的成体神经元内在再生能力。通过调控外源性抑制因素,比如敲除Nogo、促进CSPGs的降解等方式,发现脊髓损伤动物的再生能力有所增加、轴突可塑性增强,部分研究甚至观察到小鼠具有更好的行为学表现。但是,在这些针对局部抑制因素的调控措施中,很少观察到长距离(>1 mm)的轴突再生。而且,调控外源性因素对控制随意运动最重要的传导束-皮质脊髓束(corticospinal tract,CST)的再生影响有限。另外,增强的神经可塑性和出芽再生也能够在一定的康复训练策略中获得。以上研究提示,提高中枢神经元的内源性再生能力可能更为重要。研究发现,敲除Pten(phosphatase and tensin homolog,磷酸酶及张力蛋白同源物)基因能够提高神经元的的内源性轴突再生能力。Pten是一种肿瘤抑制基因,具有脂质和蛋白磷酸酶两种活性,对PI3K/AKT/m TOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,m TOR)具有负调控作用。m TOR通路的激活几乎都能够改变目前所有已知的细胞代谢状况,促进生长所必须的结构单位和大分子物质的合成,在接受细胞生长信号刺激和调控细胞代谢状态过程中起了核心控制作用。m TOR不仅可以被营养物质、生长因子或特定的细胞环境所激活,其活性也随着CNS的发育(视神经节细胞、皮质神经元)完成而下调。条件性敲除视神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)的Pten基因可以促进钳夹损伤的视神经轴突出现明显的再生反应。激活的m TOR信号通路还有效的减少了由损伤引起的RGC细胞死亡。同样,在脊髓损伤模型中也发现条件性敲除皮质神经元的Pten基因能够促进皮质脊髓束(corticospinal tract,CST)的轴突再生,随后,该方法被越来越多的实验室重复并且证实有效,成为调控再生内源性因素的核心分子通路。但是在以往这些针对PTEN和m TOR的再生研究中,学者们大多采用转基因小鼠(将目的基因插入Lox P位点之间,以实现条件性敲除)作为研究对象;由于起始表达时间较慢,携带Cre同源重组酶的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)也需要在损伤之前数周(一般四周,甚至更长时间)注射到感觉运动皮质。RNA干扰(RNAi)作为有效沉默或抑制目标基因表达的方式已经被广泛运用于医学基础研究中。但是,在活体研究中,Sh RNA和Si RNA都需要铆定于相应的病毒载体上。而目前感染非分裂细胞(皮质神经元)的慢病毒和腺相关病毒存在持续表达、基因组整合等不确定的风险,加之Pten持续敲除增加了发生肿瘤、癫痫等风险。这些问题的存在限制了调控内源性再生能力以促进轴突再生、治疗脊髓损伤的临床转化可能。基于HIV-1的Tat的蛋白降解肽-Degron是一种能够有效、快速、可逆的诱导细胞内目标蛋白降解,实现蛋白水平调节的干预方式。该肽段包含三个部分:Tat结构域,负责穿膜;蛋白结合域,负责与目标蛋白结合;降解诱导序列。研究显示,利用该方法敲减(death associated protein kinase 1,DAPK1)并诱导神经保护作用。而且,最近一项利用该方法NA-1降解肽的研究(目标蛋白为PSD95,敲减后有神经保护作用)在92例脑卒中患者中做了II期的临床试验,初步证明本方法安全有效。因此,该方法有望成为调控体内靶标蛋白表达的重要备选方式,逐渐受到关注。本研究中,我们设计了特异性的针对PTEN的降解肽,并在体外培养的神经元和脊髓损伤模型中验证了该Degron对轴突再生的促进作用。最后我们将探讨在敲除Pten激活m TOR信号通路的基础上利用化学遗传学方法提高神经活动对脊髓损伤小鼠轴突再生的促进作用和功能恢复作用。主要方法:1、利用自行设计的钳夹钳制备小鼠颈5(C5)脊髓钳夹损伤模型;使用圆筒试验、水平楼梯、梳理测试、厢式食物抓取试验、BMS评分等方式评价C5脊髓钳夹伤模型小鼠的行为学特点;利用免疫荧光法检测脊髓损伤局部GFAP、CSPGs、Iba-1、MAG、Nogo-A等抑制性蛋白和胶质激活情况;使用顺行示踪法评价控制随意运动的皮质脊髓束、红核脊髓束在损伤后的情况;使用逆行示踪法分析SCI后皮质神经元和红核神经元m TOR通路的活性。2、根据文献,设计、合成针对PTEN蛋白的Degron;建立体外培养皮质神经元和背根神经节神经元(DRG)并验证;使用WB检测PTEN Degron对培养神经元PTEN蛋白的敲减情况;使用免疫荧光检测PTEN Degron对神经元突起的生长情况和m TOR通路的激活情况;制备人工CSPGs抑制性微环境,检测PTEN Degron对DRG生长的刺激作用。3、利用皮质局部注射和微量泵持续泵入两种手段分别检测PTEN Degron对皮质神经元m TOR通路的激活情况;免疫荧光法检测PTEN Degron注射后对皮质存在的可能炎症反应和胶质细胞刺激;使用两种颜色示踪剂,顺行示踪CST以检验PTEN Degron持续微量泵入对C5钳夹伤小鼠的轴突再生促进作用;检测PTEN Degron对SCI小鼠行为学的影响。4、利用化学遗传法DREADDs(特异性药物激活的特异性受体)和转基因手段,混合携带重组酶Cre的腺相关病毒AAV1-Cre-GFP和AAV8-h M3Dq-m Cherry皮质注射。Cre酶可以敲除Ptenfl/fl小鼠的Pten基因,同时在N-氧化氯氮平(CNO)的出现下提高神经活动;使用免疫荧光法观察皮质m TOR通路的激活情况和神经活动的提高情况;观察CST的轴突再生情况;行为学检测SCI小鼠运动功能的恢复。主要结果:1、C5脊髓钳夹损伤主要引起动物上肢精细运动功能的持久障碍,相比对照组差异明显,P<0.05;该模型对动物下肢的步行活动影响较小,动物一般情况较好;皮质脊髓束(CST)和红核脊髓束(RST)均因损伤而断裂,即使等到SCI后八周仍然没有任何再生的迹象,轴突回撤(Retraction or Die back)现象明显;SCI后局部再生抑制蛋白Nogo-A、MAG、CSPGs等表达明显上调,P<0.05,星形胶质和小胶质细胞激活明显,表达相应蛋白增多,P<0.05;SCI后皮质和红核神经元m TOR活性水平明显下降,相比sham组差异明显,P<0.05。2、成功建立皮质神经元体外培养体系并合成PTEN降解肽(Degron);PTEN Degron干预4小时神经元PTEN蛋白便被有效的敲减,P<0.05,这种现象持续时间长达48小时,且能被蛋白酶体抑制剂MG132阻断;PTEN Degron能有效促进DRG神经突起的生长,提高神经元p-S6表达水平,P<0.05,MG132或雷帕霉素能阻断PTEN Degron的作用;在CSPGs抑制性微环境中,PTEN Degron同样能促进DRG生长,P<0.05。3、PTEN Degron皮质注射后4小时便引起皮质神经元p-S6表达增加,这种现象持续在注射后3天消失;PTEN Degron注射引起一过性的皮质Iba-1胶质激活和Neu N表达下调;PTEN Degron 30μg/d的持续微量泵泵入同样能激活皮质神经元m TOR活性;PTEN Dgron泵入能促进泵入侧CST的出芽再生,缓解轴突回撤,P<0.05;PTEN Degron对病灶远端的轴突再生没有明显的促进作用,P>0.05;PTEN Degron对SCI小鼠的上肢精细运动功能恢复没有明显促进作用,P>0.05。4、单独敲除Pten或提高神经活动对CST轴突再生都有促进作用,若将二者联合应用,对SCI后轴突再生的刺激作用更强,P<0.05;联合m TOR和刺激神经活动有利于动物上肢精细运动功能的恢复,P<0.05。主要结论:1、C5脊髓钳夹与临床相关性密切,适合作为轴突再生的研究模型,且可以进行与CST再生相关的随意运动功能检测。SCI不仅引起局部抑制性微环境的形成,还导致神经元轴突内源性再生能力下降。2、PTEN Degron能快速敲减培养神经元PTEN蛋白,激活m TOR通路,促进DRG突起的生长。PTEN Degron发挥作用的机制和蛋白酶体功能及m TOR通路有关。3、PTEN Degron体内应用同样能快速激活m TOR通路,发挥有限的促进轴突出芽再生的作用。PTEN Degron侧脑室泵入两周不足以促进SCI小鼠运动功能的恢复。4、联合调控m TOR和神经活动对SCI后轴突再生具有明显的促进作用,改善动物上肢精细运动功能的恢复。