【摘 要】
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Levan-型果聚糖是一种果糖均聚物,其被酸水解后可生成Levan-型低聚果糖益生元。由于果聚糖具有多种优异特性而应用于医药、工业、食品和化妆品等领域。Bacillus amyloliquefaciens LL3能同时以蔗糖为底物合成γ-PGA（γ-聚谷氨酸）和Levan-型果聚糖。为了提高果聚糖产量,本研究以敲除γ-PGA合成酶的突变株NK-ΔLP为亲本菌株进行代谢途径优化。从两个角度对NK-Δ
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Levan-型果聚糖是一种果糖均聚物,其被酸水解后可生成Levan-型低聚果糖益生元。由于果聚糖具有多种优异特性而应用于医药、工业、食品和化妆品等领域。Bacillus amyloliquefaciens LL3能同时以蔗糖为底物合成γ-PGA（γ-聚谷氨酸）和Levan-型果聚糖。为了提高果聚糖产量,本研究以敲除γ-PGA合成酶的突变株NK-ΔLP为亲本菌株进行代谢途径优化。从两个角度对NK-ΔLP进行代谢改造:转录调控角度;果聚糖蔗糖酶分泌角度。在转录调控方面,为了提高果聚糖产量,筛选了6个芽孢杆菌属强启动子,其中启动子Pgrac驱动sac B的转录效果最佳,相对转录水平提高了14倍,且重组菌ΔLP/pHT-Pgrac的果聚糖产量达到24.3 g/L,是亲本菌株产量的2.07倍;为了优化菌株整体代谢能力,将5个调控因子分别置于Pgrac启动子下游进行过表达,其中过表达过渡态调控因子AbrB的重组菌ΔLP/pHT-abr B的生长情况在整个发酵期间均优于NK-ΔLP,调节碳代谢关键因子CcpA的过表达菌株ΔLP/pHT-ccpA的果聚糖产量最高,较NK-ΔLP提高97.7%。在果聚糖蔗糖酶的分泌方面,为了提高果聚糖蔗糖酶的胞外运输,筛选了8个信号肽分别替换sac B原始信号肽并置于Pgrac启动子下游,在信号肽SPync M作用下,重组菌ΔLP/pHTSPync M果聚糖蔗糖酶的胞外活性分别是NK-ΔLP和ΔLP/pHT-Pgrac的8.57倍和2.68倍,分泌效率由69.88%提高至89.89%,同时果聚糖产量是亲本菌株的2.18倍;为了克服芽孢杆菌细胞壁对果聚糖蔗糖酶形成的分泌压力,在NK-ΔLP中分别敲除介导肽聚糖交联的基因dacA、dacC和dacF,结果显示基因敲除后菌株生长性能及细胞干重都受到一定影响,但胞外酶活、分泌效率以及果聚糖产量均有所提高,其中dacF缺失突变株的果聚糖产量比亲本菌株提高了60.3%。
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