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Wap65蛋白(Warm temperature acclimation 65k Da protein)是一种血浆蛋白,最开始是在金鱼、鲤鱼体内发现的。实验结果表明,金鱼和鲤鱼在高温诱导下,有一种分子量为65 k Da的蛋白大量存在于各组织中,被命名为Wap65,此蛋白与哺乳动物的血红素结合蛋白高度同源。蓝点马鲛(Scomberomorus niphonius)属于辐鳍亚纲,鲈形目,鲭亚目、鲭科、马鲛属,广泛分布于北西太平洋部、我国产于东海、黄海和渤海,最为著名的是在南海的海南文昌铺前的附近海域。因为近些年来,人们对蓝点马鲛的肆意捕捞和环境的不断恶劣,致使蓝点马鲛的产量快速减少,为了减少对蓝点马鲛的伤害,当前已经在中国宁波象山建立了蓝点马鲛的保护基地。蓝点马鲛属近海温水性洄游鱼类,所以高温是蓝点马鲛的生存及生产的重要因素之一。1.蓝点马鲛头肾cDNA文库的构建提取蓝点马鲛头肾的总RNA,逆转录合成cDNA,运用了SMART技术构建蓝点马鲛头肾的cDNA文库。使用NCBI的Vec Screen程序识别所测序列,去除载体,利用DNAStar软件的Seq Man程序对多序列进行了比对,将获得的EST序列在Gen Bank上进行BLAST比对分析,得到一些具有特殊功能的基因。2.两种不同的Wap65基因cDNA克隆以及mRNA的表达特征分析通过NCBI找出同源性较大的几种鱼类的Wap65-1和Wap65-2的cDNA序列,在保守区设计简并性引物,克隆两种Wap65的部分片段。然后依据已得到Wap65-1和Wap65-2基因的部分片段分别设计3’和5’RACE特异性引物,利用Gene Racer TM Kit扩增得到cDNA。Wap65-1和Wap65-2基因的cDNA长度分别为1659 bp和1725 bp,各自编码426和436个氨基酸。其中,Wap65-1基因5’和3’非翻译区的碱基长度分别为71 bp和307 bp,开放阅读框(ORF)为1281 bp;Wap65-2基因5’和3’的非翻译区的碱基长度分别为83 bp和331 bp,开放阅读框(ORF)为1311 bp。通过生物信息学软件分析了Wap65基因编码氨基酸序列的相似性,发现两种不同的Wap65基因与其它鱼类的的氨基酸序列具有相似。将蓝点马鲛的幼体在20℃,25℃,30℃,35℃的温度下进行1 h的热诱导,然后提取总RNA,并逆转录为cDNA,用于荧光定量表达分析。q RT-PCR结果表明:蓝点马鲛Wap65-1基因和Wap65-2基因在20℃,25℃,30℃,35℃分别都有表达,而Wap65-2随着温度的增高,其表达量明显增高,这一结果与所查文献所得出的结果类似,在蓝点马鲛体内,主要参与温度调节的基因是Wap65-2。3.蓝点马鲛两种Wap65基因的原核表达及蛋白功能研究设计特异性引物,扩增两个基因ORF,双酶切后进行重组质粒的构建,并导入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)IPTG诱导,将诱导的菌液进行45℃的热刺激,当处理15,30,45和60min后,Wap65-1细菌存活率分别是40%,22%,15%,7%,Wap65-2细菌的存活率为75%,60%,45%和30%,而空白组(含pCold TF)细菌存活率在上述各时间点分别是30%,17%,10%和5%。这说明热刺激条件下,Wap65-2与空白对照组比较具有显著性差异,说明Wap65-2对细菌起到了一定程度的保护作用。总之,本研究中蓝点马鲛的头肾文库的构建,帮助我们发掘了一些具有特殊功能的基因序列,具有一定的参考价值。克隆了蓝点马鲛两种Wap65基因的cDNA全长,并对其进行耐热性分析,以及原核表达,丰富了水生生物Wap65的研究,为以后更深入的研究提供了基础,也希望可以为蓝点马鲛耐热品种的培育提供帮助。