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白细胞介素2主要是由激活的T淋巴细胞产生的一类重要的细胞因子，具有激活淋巴因子活化的杀伤细胞和自然杀伤细胞，刺激T辅助细胞和自然杀伤细胞产生细胞因子和促进细胞因子的繁殖以及刺激T细胞在体外生长等功能，因此它在免疫调节中有重要作用。DuIL-2基因的成功克隆与活性的测定具有十分重要的意义。本研究旨在获得具有生物学活性的rDuIL-2，为构建新型基因工程疫苗奠定基础。
1.原核表达的鸭重组IL-2成熟蛋白(rDuIL-2)制备试验
根据Genbank发表的DuIL-2基因序列设计并合成了特异性引物，以经ConA诱导的广州鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增出长度约为360bp的目的基因片段。将该基因克隆到pMD18-T Simple Vector上，经酶切、PCR鉴定及序列测定，结果表明获得了DuIL-2成熟蛋白基因的完整克隆。将目的基因克隆至原核表达载体pET-32a，构建的表达质粒pET-IL-2，转化大肠杆菌BL21。经过优化重组菌株表达条件，进行高效表达。表达菌液经过超声破碎之后，提取可溶性融合蛋白进行亲和层析纯化。
2.酵母表达的鸭重组IL-2成熟蛋白(rDuIL-2)制备试验
应用特异性引物，以制备的DuIL-2的cDNA为模板，扩增DuIL-2成熟蛋白基因。将目的基因克隆至真核表达载体pPICZaC载体，构建重组质粒pPICZαC-IL-2，转化大肠杆菌DH5α进行扩增。将经过鉴定为阳性重组质粒线性化处理后电转化至毕赤酵母菌株X33。采用抗生素ZeocinTM筛选整合菌株，以PCR反应鉴定阳性克隆。将筛选获得含DuIL-2成熟蛋白基因的重组酵母菌株通过BMGY/BMMY培养基两步法培养、用甲醇诱导表达，诱导菌液上清用SDS-PAGE电泳分析。
3.表达重组DuIL-2成熟蛋白的活性检测
复性后的原核表达纯化的rDuIL-2和纯化处理的酵母表达的rDuIL-2采用MTT法检测其对鸭外周血T淋巴细胞增殖反应的影响。
本论文的研究结果:
1.成功克隆了DuIL-2成熟蛋白基因片段，大小约为360bp，编码119个氨基酸，与GenBank上登陆的DuIL-2成熟蛋白基因序列同源性为99.2％～99.4％，其推导氨基酸序列同源性为为98.3％～99.2％。
2.成功构建了DuIL-2基因原核表达质粒pET-IL-2，优化了其最佳表达条件。在
含Amp100μg/mL的LB诱导培养基中，37℃以1mmol/LIPTG诱导培养3h。经培养表达、纯化，获得了1mg/mL重组DuIL-2。经SDS-PAGE分析，在约33KDa处出现新的蛋白条带，Western-blot分析表明，融合蛋白能够被抗His单克隆抗体识别。
3.成功构建了重组DuIL-2成熟蛋白的酵母重组表达载体pPICZαC-IL-2。该重组表达载体线性化后电转化入巴斯德毕赤酵母菌株X33中，酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了rDuIL-2，SDS-PAGE测定，证实DuIL-2基因在Pichia pastoris中表达成功，表达的rDuIL-2分子量约为14.3KDa。
4.应用MTT方法测定了rDuIL-2的活性。结果显示，重组酵母菌株X33-IL-2表达产物和BL-21-IL-2表达产物具有体外维持活化鸭淋巴细胞的生长和增殖能力，表明表达产物所含的rDuIL-2具有生物活性。