肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织估计，我国2000年世界人口调整肺癌男性发病率为38.46/10万，死亡率为33.21/10万。女性调整发病率为15.70/10万，死亡率为13.45/10万，居各类恶性肿瘤死亡率首位。尽管近年来化疗、放疗有了长足的进步，但肺癌总的长期生存率并未得到明显提高。当肺癌被确诊时，65％属于晚期，失去了手术机会，早期患者手术后需要接受辅助化疗，术后几年内很多患者也会出现复发和转移，因此几乎所有的非小细胞肺癌患者均需要进行辅助化疗或者姑息化疗。化疗是目前可以控制远处转移的主要治疗方法，但其缓解率低，临床试验显示第三代化疗药物作为一线化疗的有效率约为30～40％，二线化疗的有效率仅有10％，且几乎所有患者最终将出现新的转移病灶，因此发展新的治疗方法成为研究的热点。 近年来，随着对于肿瘤细胞信号传导途径的研究不断深入，人们对肿瘤的发生、发展、复发及转移的分子机制认识越来越深入，针对肿瘤细胞信号传导通路特异性分子靶点抗肿瘤治疗新方法，具有针对肿瘤治疗特异性强的优点，效果显著，是肿瘤治疗中甚具前景的方法。在非小细胞肺癌中EGFR的研究最为深入。 临床上EGFR-TKI通过与ATP竞争EGFR胞内区激酶催化位点，阻断EGFR激酶活性。吉非替尼(Gefitinib，IressaTM)是一种特异性的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，通过竞争性地抑制ATP与受体胞内区结合，从而抑制酪氨酸激酶活化，阻断EGFR的传导通路，达到抗肿瘤治疗的目的。 临床试验结果显示吉非替尼的疗效在不同的人群中差异较大，日本患者和欧洲患者中有效率分别为27.5％和10.4％。2004年，研究报道发现EGFR基因18、19、21外显子突变的NSCLC患者对吉非替尼的疗效较好，而这种突变多见于东亚人种、女性、非吸烟者、腺癌的患者。但在临床中却显示部分EGFR基因野生型的患者同样对吉非替尼治疗疗效较好，也有研究结果提示除了EGFR突变，EGFR-TKI治疗的疗效还与EGFR基因的拷贝数有关。因此影响吉非替尼疗效及预后的原因尚不明确。 本研究通过检测对中国NSCLC患者EGFR基因突变的情况，试图阐明突变与临床之间的关系，探讨EGFR基因突变对。EGFR-TKI治疗疗效和预后的预测价值；通过原代培养的方法建立EGFR基因野生型EGFR高拷贝数的肺癌细胞系并对其进行鉴定；通过观察吉非替尼对该肺癌细胞系EGFR下游信号通路分子表达的影响，探讨EGFR-TKI药物对EGFR基因野生型EGFR高拷贝数的肺癌细胞系生长及下游信号传导的影响。 第1章 NSCLC患者EGFR基因突变的检测与临床意义 材料与方法 1、病例选择： 研究包括从2002年至2005年期间在广东省人民医院接受手术的144例非小细胞肺癌患者，所有患者均签署了知情同意书，手术切除的肿瘤组织立刻置于液氮中，然后保存于-80℃。其中27例患者在疾病出现进展，二线化疗失败后接受了吉非替尼250mg口服／天治疗，直至疾病再次进展或出现不可耐受的毒副作用，患者在治疗后4周接受胸片或CT检查评价疗效，以后每3个月复查一次，疗效评价按照RECIST标准。组织病理学分型按照WHO标准。 2、基因组DNA的提取： 采用Trizol一步法提取肿瘤组织的的RNA和DNA。 3、PCR扩增EGFR基因与测序： 采用巢式PCR扩增EGFR基因18、19、21外显子，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后回收纯化PCR产物，BigDye标记测序序列后上机测序。 4、统计方法： 以P＜0.05作为有显著性差异的标准。不同组间突变率的差异采用x2检验或者Fisher精确概率检验。多因素分析采用logistic回归模型进行检验。疾病进展时间比较采用Kaplan-Meier检验。统计分析采用SPSS软件进行。 结果 在27例接受吉非替尼治疗的患者(20例腺癌、3例肺泡细胞癌、2例鳞癌、2例大细胞癌)中，总的有效率(CR+PR)为48.1％(13/27)；男性和女性分别为43.8％(7.16)和54.5％(6/11)，p=0.436；非吸烟者和吸烟者分别为60％(9/15)和33.3％(4/12)，p=0.090；腺癌和非腺癌分别为56.5％(12/23)和O％(0/4)，p=0.057，EGFR野生型和突变型患者疾病控制率分别为36.4％(4/11)和56.3％(9/16)，p=0.267。男性和女性的中位TTP没有显著差异(16个月VS.13个月，p=0.411)，不同吸烟状况的患者中位TTP没有显著差异(14个月vs．11个月，p=0.714)，EGFR基因野生型和突变型患者的中位TTP也没有显著差异(14个月VS．13个月，p=0.906)。 第2章肺癌细胞系的建立与鉴定及EGFR功能相关检测 材料与方法 1、肿瘤细胞的分离培养： 分别采用从肿瘤组织中和从胸腹水中分离培养肿瘤细胞，从肿瘤组织中分离培养肿瘤细胞采用酶消化法分离细胞，分离后滤网过滤后接种，从胸腹水中分离培养肿瘤细胞则采用无血清培养液培养细胞以减少间皮细胞的干扰。 2、肿瘤细胞系的鉴定： 当肿瘤细胞系传代超过60代后对其生长特性进行了鉴定，包括：细胞生长曲线的绘制，染色体分析，流式细胞仪检测细胞周期，软琼脂培养克隆形成试验，动物接种实验。 此外采用巢式PCR扩增、琼脂凝胶电泳纯化后直接测序对肿瘤细胞系EGFR基因突变进行检测，利用FISH检测了 EGFR基因拷贝数。 结果 肿瘤细胞系的鉴定：细胞生长曲线分析显示细胞倍增时间为27.1小时；细胞染色体分析表明染色体数量为66～78，并具异常染色体核型；流式细胞仪检测肿瘤细胞周期分布为G1期占69.05％，G2期占11.32％，S期占19.63％；软琼脂培养克隆形成率为27.3％。动物接种后第7天肿瘤开始形成。 肿瘤细胞的测序显示3株肿瘤细胞系EGFR基因18、19和21外显子均为野生型。EGFR基因拷贝数FISH检测结果提示3株细胞系EGFR基因属于平衡多倍体型。其中2例患者接受EGFR-TKI治疗疗效较好。 第3章 EGFR-TKl对肺癌细胞EGFR及其下游信号分子表达的影响 材料与方法： 采用MTT法检测吉非替尼对肿瘤细胞系的杀伤，确定IC50的范围；通过在细胞生长环境中加入适量吉非替尼阻断细胞EGFR信号通路后，比较肿瘤细胞生长的变化；采用Trizol一部法提取肿瘤细胞的RNA后，利用Real-Time PCR检测EGFR、raS及其下游信号通路MAPK、P13K／AKt重要分子表达的变化。对不同基因的扩增效率进行检测后，采用2-△△Ct法比较基因表达的差异。 结果 MTT法结果显示吉非替尼在低浓度时即可对肿瘤细胞系的生长产生抑制，而IC50在4μM左右。 肿瘤生长环境中加入吉非替尼后，细胞的生长受到了明显的抑制，活力显著下降，细胞出现死亡。 基因扩增效率的测定显示，几个基因与内参β-actin相比扩增效率一致，可以应用2-△△Ct法比较基因表达的差异。 结论 1．对于中国NSCLC患者，EGFR基因突变的预测因子主要是病理类型和吸烟状况，性别并不能预测患者的EGFR突变情况； 2．腺癌、女性、非吸烟患者、EGFR突变型患者接受吉非替尼治疗的疗效较好； 3．吉非替尼对中国肺癌患者有效率为48.1％，高于中国人群EGFR基因突变 率的27.8％，提示存在影响吉非替尼疗效的其它因素。 4．胸腹水中提取肿瘤细胞进行原代培养可以作为肿瘤细胞原代培养的一条重要途径； 5．细胞系EGFR基因野生型细胞系可以表现为EGFlR高拷贝数型，EGFR基因突变和EGFR基因的拷贝数增加之间并无一致性。 6．EGFR基因野生型但拷贝数增高的患者接受EGFR-TKI可以有较好的疗效。 7．吉非替尼对原代培养细胞系的IC50为4gM。 8．吉非替尼在低浓度下对EGFR野生型而EGFR高拷贝数的肺癌细胞具有较强的杀伤作用； 9．吉非替尼对于EGFR野生型而EGFR高拷贝数的肺癌细胞的EGFR和RAS基因表达无明显影响； 10．吉非替尼对EGFR高拷贝数肺癌细胞的MAPK、P13K／Akt信号通路有显著的抑制作用，和未抑制相比，MAPK为0.529倍，P13K为0.148倍，Akt为0.195倍。 11．EGFR基因高拷贝数与EGFR-TKI治疗疗效之间可能存在一定关系。 创新点 1、本研究大规模的检NT中国NSCLC患者EGFR基因突变的分布情况，并提出性别并不能预测患者的EGFR突变情况； 2、通过原代培养成功培育了一株肺癌细胞系并进行了初步鉴定，该细胞系具有明显的恶性肿瘤结构和生长特性，EGFR基因为野生型且为高拷贝数； 3、阐明了吉非替尼对于EGFR野生型而EGFR高拷贝数的肺癌细胞系生长及 EGFR及其下游信号通路分子基因表达的影响。