论文部分内容阅读
1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco,E.C.4.1.1.39）位于叶绿体基质中，是一个双功能酶，它参与了植物光合作用和光呼吸过程，在调节两者之间的关系中起重要作用。Rubisco又是植物蛋白中含量最丰富的蛋白，约占叶总蛋白的12-35％，叶片可溶性蛋白的50％（Makino et al.,1983），是植物体内重要的储藏蛋白，它在叶片衰老早期快速降解，为新生组织提供必需的氨基酸（Feller and Fischer 1994）。Rubisco的降解情况不仅直接影响植物的光合效率，而且会影响植物对氮素的利用，所以搞清Rubisco降解的机制对了解Rubisco的生理功能具有重要的意义。目前，有关Rubisco的结构、合成、定位以及活性调控方面都研究得比较清楚，但有关Rubisco的降解及其机理仍然知之甚少（Hortensteiner and Feller 2002;Houtz and Portis 2003）。本文主要对小麦叶片中Rubisco大亚基的降解以及相关蛋白水解酶的情况进行了研究。主要研究工作及结果如下：首先，我们以小麦（Triticum aestivum L．cv．Yangmai 158）叶片为材料，根据Rubisco的溶解度、分子大小和形状、电荷性质等特性采用盐析、凝胶过滤、离子交换层析技术进行了该酶的分离、纯化。最后在普通电泳的基础上，利用改进的电洗脱法在蛋白回收槽中，回收和纯化Rubisco，方法简单且纯度高。纯化的Rubisco经SDS-PAGE凝胶电泳检测呈2条谱带，一条带为Rubisco大亚基，分子量53kDa左右；另一条为Rubisco小亚基，分子量14.8kDa左右。接着，我们以纯化的Rubisco为抗原，免疫新西兰白兔，成功地获得了Rubisco抗体。然后，我们对成熟叶片中Rubisco大亚基的降解情况进行了研究，通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白质杂交的方法，在成熟叶片的粗酶液中检测到一条分子量为51kDa的Rubisco大亚基的裂解产物，且在pH5.5，温度30-35℃时，该51kDa的条带显示最明显。当反应液处理60 min时，大亚基和51kDa的裂解产物并存，大亚基的量随着反应时间的延长而减少。通过不同的蛋白酶抑制剂处理，发现这一步反应能被半胱氨酸型蛋白水解酶抑制剂E-64和leupeptin完全抑制。但在成熟叶片叶绿体裂解反应液中并没有发现该51kDa条带。蛋白质降解是叶衰老过程中的一个重要事件，因此我们又进一步研究了暗诱导衰老小麦叶片中Rubisco大亚基降解情况，发现在粗酶液和叶绿体裂解液中均能发现有51kDa的Rubisco大亚基片断。并通过超离的方法把叶绿体基质和膜分离后发现在叶绿体基质中存在51kDa的产物。N末端氨基酸测序表明Rubisco大亚基是在14位的Lys和15位的Ala处发生了裂解。并发现金属蛋白水解酶抑制剂EDTA和1，10-phenanthroline以及丝氨酸型蛋白水解酶抑制剂AEBSF能抑制Rubisco大亚基的这一断裂反应。结果说明，在暗诱导衰老叶片的叶绿体基质中存在一个能把Rubisco大亚基从53kDa降解成51kDa的蛋白水解酶。另外，叶片粗酶提取液在pH 6.0-6.5的缓冲液在30-35℃的温度下处理一段时间，还发现了一条分子量为50kDa的Rubisco大亚基降解产物，但在叶绿体中检测不到。半胱氨酸型和丝氨酸型的蛋白水解酶抑制剂都能抑制这步反应。这可能是一个液泡中的蛋白水解酶在起作用。接下来又研究了ATP及Zn2+对Rubisco降解的影响，结果发现成熟叶片的粗酶液在pH7.5的条件下，只要加入终浓度为1mM的ATP并处理一段时间时51kDa降解片段则会出现。同时还发现了成熟叶片叶绿体的裂解液在含有1mM的ATP和1μM Zn2+的pH7.5的缓冲液中保温6h后，也能检测到51kDa的产物。通过蛋白酶抑制剂实验得知，粗酶液和叶绿体中起作用的蛋白水解酶不是同一类型的蛋白酶，并且最适pH值也不同，在粗酶液中该酶在偏酸和偏碱性的条件下都能起作用，在叶绿体中Rubisco大亚基只在偏碱性的条件下才会降解。因此说明在叶绿体中和粗酶液中很可能是两种不同的蛋白酶在起作用，且在衰老叶绿体中起作用的这种蛋白水解酶可能并不是在叶片衰老过程中合成的，因为它在成熟叶片的叶绿体中就存在。此外，我们应用Tricine—SDS—PAGE电泳系统被用来探讨Rubisco大亚基是否被目标蛋白酶剪切成51kDa的片段和2kDa或1kDa的小肽，但结果未检测到反应体系中含有1-2kDa的小肽，其原因可能是目标蛋白酶在将Rubisco大亚基降解过程中水解成了51kDa的片段和一些分子量小于1kDa的寡肽片段。为了更进一步了解Rubisco降解相关蛋白酶的一些基本情况及生化特性，应用定量RT-PCR的方法检测了小麦叶片自然衰老过程中叶绿体内蛋白水解酶clpP的mRNA水平上的变化，结果表明在叶衰老过程中ClpP基因在mRNA水平上是逐渐减少的。因此，Clp可能不是前面发现的能把Rubisco大亚基降解成51kDa片断的蛋白水解酶，这可能是一个未知的新的蛋白水解酶在起作用。以上研究结果不仅有助于丰富叶片，尤其是叶绿体内Rubisco降解情况及相关蛋白水解酶的类型及其生化特性等方面的基础理论知识，而且有助于阐明，尤其叶片衰老过程中Rubisco迅速被降解的分子机制，从而能够为今后农业生产实践上采用合适的延缓作物叶片衰老措施，提高作物产量和品质提供一定的科学依据。