目的和意义巨细胞病毒(CMV)是造血干细胞移植后最常见机会性感染源之一,在造血干细胞移植早期CMV疾病的死亡率达80%以上,早期预防和诊断是减少CMV疾病发生的关键。CMV感染和致病受到病毒本身基因、宿主基因和机体免疫因素的影响,本研究目的是探索CMVgB基因分型和造血干细胞移植前供受体HLA和非HLA基因,KIR基因,以及移植后受体免疫状态等因素对CMV感染致病的影响,为合理选择供体,制定合适的病毒预防方案提供参考价值。方法第一部分选择2004年7月至2010年5月接受造血干细胞移植并且CMV-DNA阳性的115例CMV感染者,采用荧光定量PCR检测病毒载量,聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法和克隆测序对所有CMV感染者的CMV-DNA进行CMVgB基因分型鉴定,分析不同CMVgB基因型患者病毒载量,抗病毒治疗时间以及CMV疾病发生的差异。第二部分选择2004年10月~2010年10月行造血干细胞移植供受体433对,移植前采用序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR/SSO)低分辨分型方法对供受体HLA-Ⅰ抗原以及HLA-Ⅱ类抗原进行检测,移植后2周起,每周采用荧光免疫组化法检测移植后患者外周血CMVpp65抗原结合临床资料,分析在CMV阳性组与CMV阴性组,CMV抗原血症组与CMV疾病组供受体HLA-A,B,C,DRB1,DQB1,E位点频率的差异。第三部分选择2005年10月~2010年10月行造血干细胞移植供受体138对,移植前采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法对供受体KIR基因分型,移植后2周起,每周采用荧光免疫组化法检测移植后受体外周血CMVpp65抗原,分析在CMV阳性组与CMV阴性组,供受体KIR抑制性受体基因与激活性受体基因以及供受体KIR单体型频率的差异。第四部分选择2007年7月至2010年12月行造血干细胞移植供受体64对,采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)和基因测序方法(SBT)对非HLA基因(ACE、CD14、MPO、MBL)检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),结合CMVpp65检测结果,比较CMV阳性组与CMV阴性组ACE、CD14、MPO、MBL基因SNPs的差异。第五部分选择2008年1月~2010年12月行造血干细胞移植患者92例,移植后2周起,每周采用荧光免疫组化法检测移植后患者外周血CMVpp65抗原;采用流式技术和定量PCR方法连续检测移植后30天,60天,90天T细胞亚群重建,NK细胞受体和负调控基因SOCS1,SOCS3的表达,比较CMV阳性组与阴性组免疫状态的差异。结果第一部分①115例CMVgB基因型分布为:gB1, 42/115 (36.52%);gB2, 3/115 (2.61%);gB3, 43/115(37.39%);gB4, 2/115 (1.74%);混合分型20/115 (17.39%);还有5例(4.35%)缺乏RsaI酶切位点,我们命名为gB5;②CMVgB1型CMV-DNA拷贝数的中位数位2.7×10~3(1.81×10~3-6.03×10~4),gB3型CMV-DNA拷贝数的中位数位4.0×103 (1.32×103-6.39×10~4 ),混合型CMV-DNA拷贝数的中位数位1.2×10(42.28×10~3-6.50×10~5),CMVgB1型和gB3型拷贝数比较,差异无统计学意义(P>0.050)。单个CMVgB基因型感染(gB1型或gB2型)与混合型感染比较,CMV-DNA拷贝数差异有统计学意义(P<0.050);③单个CMVgB感染CMV-DNA转阴中位时间14(7~34)天,混合型CMV-DNA转阴中位时间17(11~42),单个CMVgB基因型感染与混合感染比较,CMV-DNA转阴时间差异有统计学意义(P<0.050);④Logistic回归模型多因素分析,CMVgB3型感染与CMV肺炎存在相关性(P<0.050)。第二部分①433对供受体中HLA相合338对,HLA错配95对,检出HLA-A位点10个,HLA-B位点23个,HLA-DR位点13个,HLA-C位点8个,HLA-DQ位点5个。HLA-Bw4组和Bw6组分别占46.40%和53.60%,HLA-C1组和C2分别占81.22%和18.78%;②HLA全相合组CMV感染率为45.86%,在HLA全相合移植中,HLA-A24和HLA-DR15等位基因位点在CMV阳性组出现频率明显高于CMV阴性组相应的等位基因位点频率,差异具有统计学意义(P<0.050)。CMV阳性组HLA-Cw6位点出现频率明显低于CMV阴性组,差异亦有统计学意义(P<0.050),Bw4组与Bw6组比较,两组CMV感染率差异无统计学意义(P>0.050)。C1与C2组比较两组CMV感染率差异仍无统计学意义(P>0.050);③HLA错配组CMV感染率为63.16%,与HLA全相合比较两者差异有统计学意义(P<0.050)。单一位点错配组与2个位点或以上错配组比较CMV感染率差异有统计学意义(P<0.050)。A位点与C位点错配是主要的错配位点,两组CMV感染率高比较,C位点错配组CMV感染率高,差异有统计学意义(P<0.050);④CMV疾病疾病组HLA-A33,HLA-B46,HLA-B58,HLA-DR3,HLA-Cw1位点出现频率明显增高,而HLA-Cw6位点出现频率下降,差异均有统计学意义(P<0.050);⑤HLA-E基因检出2种基因型:HLA-E*0101和HLA-E*0103,频率分别为72.27%和79.83%,HLA-E*0101/0101组CMV感染率高于含HLA-E*0103等位基因组,差异有统计学意义(P<0.050)。第三部分①供受体KIR各基因型频率分布和KIR单体型频率分布差异无统计学意义(P>0.050);②在CMV阳性组供体KIR-Bx单体型中2DS2,KIR- A/A单体型中2DS4*003-007基因出现频率明显低于CMV阴性组,差异具有统计学意义(P<0.050),受体KIR各基因出现频率在CMV阳性组和阴性组无统计学差异(P>0.050);③供体KIR-B/B单体型组CMV感染率明显低于供体KIR-A/A单体型,差异有统计学意义(P<0.050),受体KIR各单体型组CMV感染率差异无统计学意义;④多因素分析结果供体携带KIR 2DS4*003-007基因和供体KIR-B/B单体型是降低CMV感染的有利因素。第四部分①ACE 16内含子基因多态性分布:DD 14/128 (10.94%),ID 72/128(56.25%),II 42/128(38.81%)。CD14-159位基因多态性分布:CC 18/128(14.06%), CT 81/128 (63.28%), TT 29/128 (22.66%)。MPO -463位点基因多态性分布: G 100/128( 78.13%), GA 26/128 (20.31%), A 2/128(1.56%)。MBL启动子-550位基因多态性分布:H 28/128 (21.88%),HL 73/128 (57.03%),L 27/128 (21.09%)。MBL启动子-221位基因多态性分布:Y 87/128(67.97%), YX 38/128(29.69%), X 3/128(2.34%);MBL外显子1区基因多态性分布:A 94/128(73.44%), AB 32/128(25.00%), B 2/128(1.56%);②CMV阳性组与CMV阴性组供受体ACE,CD14-159位点,MPO-463位点,MBL启动子-221以及外显子1区基因单核苷酸多态性差异比较无统计学意义(P>0.050),CMV阳性组供体MBL-550位点HL基因频率明显增高,与CMV阴性组比较差异有统计学意义(P<0.050)。第五部分①所有92例患者均获得造血重建,粒系造血重建的中位时间为13天(9~22天),血小板重建时间为23天(11~45天)。40例患者在移植90天内出现CMVpp65阳性,CMVpp65阳性检出的中位时间为54天(28~84天);②移植后+30天CMV阳性组CD3+T细胞比例低于CMV阴性组,差异有统计学意义(P<0.050),+60天,+90天两组差异无统计学意义(P>0.050)。移植后+30天CMV阳性组CD3+CD4+T细胞比例低于CMV阴性组,两组差异有统计学意义(P<0.050),移植后+60天,+90天两组差异无统计学意义(P>0.050)。在移植后90天内两组CD3+CD8+T细胞比例均无统计学差异(P>0.050)。移植后+60天CMV阳性组CD3-CD16+CD56+NK细胞比例高于CMV阴性组,差异有统计学意义(P<0.050);③在CMV阳性组和阴性组+30天,+60天,+90天淋巴细胞活化标志物CD3+CD25+,CD3+CD69+, CD3+HLA-DR+表达水平差异无统计学意义(P>0.050),两组在移植后+30,+60天CD3-HLA-DR+表达差异亦无统计学意义(P>0.050),但是移植后+90天,CMV阳性组CD3-HLA-DR+表达低于CMV阴性组,差异有统计学意义(P<0.050);④CMV阳性组和CMV阴性组NKG2A,NKG2D,NKp30,NKp46,CD158a在移植后+30天,+60天,+90天的表达差异均无统计学意义(P>0.050)。移植后+60天和+90天,NKG2C在CMV阳性组表达高于CMV阴性组,差异有统计学意义(P<0.050);⑤移植后SOCS1,SOCS3的表达均较正常对照明显升高,在移植后+60天表达最高,此时SOCS3表达在CMV阳性组较CMV阴性组明显高(P<0.050),而SOCS1在两组中表达没有差异(P>0.050)。结论1)CMVgB基因分型与CMV病毒载量,抗病毒治疗时间和CMV疾病有关,CMVgB3型感染是CMV肺炎的高危因素。2)HLA错配是CMV感染的高危因素,HLA相合移植中HLA-A24,HLA-DR15,HLA-Cw6和HLA-E*0101位点与CMV感染相关。3)激活性KIR基因与造血干细胞移植后CMV感染相关,供体携带KIR 2DS4*003-007基因和KIR-B/B单体型是降低CMV感染的有利因素。4)供体MBL基因的单核苷酸多态性与造血干细胞移植后CMV感染相关。5)造血干细胞移植后T淋巴细胞重建缓慢,NK细胞持续高比例存在,NKG2C和SOCS3表达增高与CMV感染相关。综上所述,造血干细胞移植后CMV疾病与CMVgB基因多态性密切相关,移植前对供受体HLA基因型,供体KIR基因型和MBL基因的单核苷酸多态性分析,移植后监测T细胞重建,NK细胞重建,NKG2C和SOCS3表达有助于CMV感染和疾病预防和治疗。