第一部分人精浆叶酸水平与精液参数的相关性分析目的:精液参数是预测男性生育潜力的良好指标,然而自上世纪三十年代以来,人类精液质量出现逐年下降,尤以精子密度最为突出,但具体原因不清。叶酸是一种重要的微量元素,参与DNA,RNA和蛋白质的合成及甲基化反应,与精子发生息息相关。以往的研究报道精浆叶酸浓度是反映机体叶酸营养状况的良好指标。因此,本课题的目的旨在探究⑴人精浆叶酸水平与精液参数(包括精子DNA碎片化指数,DFI)的相关性;⑵人精浆叶酸水平与男性不育的关系。方法:从华中科技大学同济医学院生殖医学中心和湖北省人类精子库招募受试者,经筛查合格后,收集其精液和血液标本。首先,采用计算机辅助精子质量分析系统(CASA)进行精液参数分析;用精子染色质结构分析法(SCSA)检测部分标本的染色质完整性(DFI);将标本离心后,分离上层精浆和血清,用全自动生化分析仪测定叶酸和同型半胱氨酸(Hcy)的浓度。采用SPSS 17.0软件对各测量指标进行组间比较和相关性分析。结果:经筛查,本研究共纳入419名合格受试对象,包括313名男性不育患者(其中非梗阻性无精子症71名,严重少精子症12名,少精子症45名和精子密度正常者185名)和已生育捐精志愿者106名(少精子症19名和精子密度正常者87名)。所有受试对象年龄22~51岁,平均值(31.4±5.3)岁;体重指数(BMI)17.1~31.1 kg/m~2,平均值(22.6±4.5)kg/m~2。不育组与生育组在年龄和BMI上差异不显著。所有受试者均进行了精浆叶酸水平检测,其浓度范围11.27~82.67 nmol/L,中位值26.57 nmol/L;不育组精浆叶酸浓度25.12(11.27-69.64)nmol/L显著低于生育组27.32(13.65-82.67)nmol/L(P(27)0.01)。按精子密度分组比较,无精子症[23.14(11.27-47.56)nmol/L]和严重少精子症[23.16(13.32-49.65)nmol/L]显著低于与精子密度正常者[28.12(14.75-82.67)nmol/L],差异均有统计学意义(P(27)0.05);而少精子症患者叶酸浓度[26.83(13.65-69.64)nmol/L]虽然低于精子密度正常者,但差异无统计学意义(P(29)0.05)。105名不育患者(无精子症20名,少精子症25名和精子密度正常者60名)完成了精浆和血清叶酸与Hcy检测,叶酸和Hcy在无精子症、少精子症和精子密度正常者的血清和精浆中分布无差异(P(29)0.05)。排除无精子症后,85名不育患者行DFI值测定,少精子症DFI(20.92±13.67)%低于精子密度正常者(26.61±13.67)%,但差异无统计学意义(P=0.08)。相关性分析发现在校正年龄和BMI后,精浆叶酸水平与血清叶酸水平(r=0.62,P(27)0.01)和精子密度(r=0.24,P(27)0.01)呈正相关;与DFI呈负相关(r=-0.41,P(27)0.05)。结论:精浆叶酸浓度可能是一个反映机体叶酸营养状况的良好指标。低水平精浆叶酸可能破坏精子基因组完整性,很可能抑制精子发生过程,从而导致精子密度下降,因此,精浆叶酸低水平可能是造成男性不育的一个独立危险因素。第二部分人精浆叶酸水平与精子DNA甲基化的相关性分析目的:叶酸是机体甲基的主要供体,通过一碳途径参与甲基化反应,故精浆叶酸水平可能影响精子DNA甲基化。由于精子基因组结构致密,不易获得高质量精子DNA。因此,我们的研究目的:⑴评估、优化精子基因组提取方法,并验证;⑵探究人精浆叶酸水平与精子DNA甲基化的相关性。方法:采用改良的异硫氰酸胍法、传统的酚-氯仿法和天根试剂盒法提取精子DNA,并用普通PCR和Methy Light法对上述三种方法进行比较。选取精浆低叶酸组和正常叶酸组精液标本,用简化表观亚硫酸氢盐测序(RRBS)进行精子基因组甲基化测序分析,并用重亚硫酸盐测序法(BSP)进行验证。用荧光定量PCR评价精浆叶酸水平对精子发生关键基因ESR1、CAV1及ELAVL1 m RNA表达的影响。结果:与传统的酚-氯仿法和天根试剂盒法比较,改良的异硫氰酸胍法提取的DNA产量大和纯度高,完整性好,最适合甲基化分析。与精浆正常叶酸组比,低叶酸组差异甲基化区域(DMRs)相关基因甲基化水平上升464个,下降823个。生物信息学分析发现DMRs相关基因集中于生物调节、免疫应答、细胞发育、物质代谢、损伤修复、细胞凋亡和信号通路等功能。BSP未发现精浆叶酸正常组和低叶酸组在基因ESR1、CAV1及ELAVL1启动子区甲基化水平存在显著性差异。然而人精浆低叶酸抑制基因ESR1、CAV1及ELAVL1 m RNA表达。结论:经比较和验证改良的异硫氰酸胍法提取的精子DNA量大质优,最适合甲基化分析,值得推广。精浆低叶酸浓度改变精子基因组甲基化模式,干扰精子发生相关重要基因(ESR1、CAV1及ELAVL1等)表达,可能是导致男性不育的潜在原因。第三部分叶酸缺乏通过Cav1/Perk/Eif2a/Atf4/Chop信号通路影响小鼠精子发生的在体研究目的:研究报道叶酸缺乏通过内质网应激(ER stress)途径导致生殖细胞凋亡增加,而PERK(Per K/Eif2a/Atf4/Chop)信号通路是ER stress三条主要信号通路中最重要的一条,我们的测序数据和以往研究提示Cav1表达异常可能通过PERK信号通路激活ER stress,导致细胞凋亡增加。因此,本部分的研究目的是明确叶酸缺乏对精子发生的影响并对ER stress的PERK(Per K/Eif2a/Atf4/Chop)信号通路进行初步研究。方法:用订制的饲料构建叶酸缺乏动物模型,通过附睾精子计数,HE染色,TUNEL和睾丸组织免疫荧光观察叶酸缺乏对睾丸组织的影响。运用RT-PCR和Western blot检测叶酸缺乏对Cav1等精子发生关键基因及Per K/Eif2a/Atf4/Chop信号通路表达的影响。结果:与叶酸正常组小鼠比较,叶酸缺乏降低附睾精子密度,增加睾丸组织损伤、凋亡率和DNA双链断裂率;同时,叶酸缺乏降低Cav1等基因表达,增加Per K/Eif2a/Atf4/Chop信号通路表达,差异均有统计学意义(P(27)0.05)。结论:叶酸缺乏动物模型证实低叶酸水平可损伤睾丸生殖细胞基因组完整性,增加睾丸组织细胞凋亡,降低雄鼠精子密度,抑制精子发生相关重要基因表达,且可能通过下调Cav1表达,激活PERK(Per K/Eif2a/Atf4/Chop)分子信号通路,阻碍精子发生。第四部分叶酸缺乏通过Cav1/Perk/Eif2a/Atf4/Chop信号通路诱导GC-2凋亡的体外研究目的:如本文第二和第三部分所述,叶酸缺乏可降低Cav1表达,同时激活PERK通路,而Cav1与PERK通路密切相关。为进一步探索叶酸缺乏引起细胞凋亡增加的机制,我们利用RNAi干扰技术沉默Cav1,以验证叶酸缺乏是否通过Cav1/PERK/Eif2a/Atf4/Chop途径促进细胞凋亡。方法:用无叶酸培养基处理GC-2、GC-1、TM3及TM4细胞24h。检测细胞活力(CCK-8法);流式检测细胞周期和细胞凋亡率。Si RNA瞬时沉默GC-2细胞的Cav1,用RT-PCR和Western blot检测Cav1及Per K/Eif2a/Atf4/Chop信号通路表达的影响。结果:与叶酸正常组比较,叶酸缺乏抑制细胞活力和细胞增殖;增加细胞凋亡率;同时发现叶酸缺乏降低Cav1表达,增加Per K/Eif2a/Atf4/Chop信号通路表达,差异均有统计学意义(P(27)0.05)。沉默Cav1,亦增加Per K/Eif2a/Atf4/Chop信号通路表达,差异均有统计学意义(P(27)0.05)。结论:叶酸缺乏增加小鼠睾丸细胞系凋亡率,且GC-2最敏感,提示精原细胞较为脆弱,对外界环境敏感。叶酸缺乏处理结合体外瞬时沉默Cav1实验,提示叶酸缺乏可能通过下调Cav1表达,进而激活Per K/Eif2a/Atf4/Chop信号通路,从而增加精原细胞系凋亡。