第一部分基于TCGA分析的AML患者中Notch1相关基因的筛选研究背景:急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种在分子表型上高度异质性的疾病,其特点是造血干/祖细胞的恶性转化。在白血病前期和疾病发展的过程中,受影响的造血细胞逐渐积累了一系列分子变化,包括细胞的体细胞突变、基因组遗传学异常、表观遗传学变化和转录组学变化。通过新一代测序手段,已在AML中鉴定出多种基因水平改变、表观遗传学变化和细胞遗传学异常,并在AML的临床诊断治疗中发挥重要的指导作用。近年来,基于公共数据库以及生物信息学分析,发现更多AML相关的分子生物学指标成为该领域研究的热点,将有助于提高对AML发生发展机理的认识,并为临床提供新的诊断治疗及预后检测的生物标志物及靶点。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）项目是由美国国立卫生研究院（National Institute of Health）支持的多中心研究,旨在通过大规模的高通量测序和生物信息学分析,挖掘30多种人类肿瘤中的主要致癌基因。目前该数据库包含约20,000例肿瘤患者的样本及临床病理信息,其中AML病例203例,均可提供公开的肿瘤基因组数据,用以协助改进肿瘤的诊断方法、治疗标准,最终达到早期诊断及治疗的目的。TCGA数据库的建立,为肿瘤的分子生物学研究提供了一个蕴藏丰富的宝藏,将有助于提高对肿瘤机理的认识。Notch信号通路是一种在物种间高度保守的信号通路,对于细胞正常功能的维持具有重要意义。其由Nocth受体（Nocth1-4）,Nocth配体（DSL）和CSL（一类DNA结合蛋白）等组成,通过细胞与细胞间的信号传递参与了生物体内的多种病理生理学过程,如细胞干性的维持、细胞凋亡的调节和免疫反应等。其中,Notch1受体可被配体结合并激活,进而引起Notch1细胞内结构域（NICD）的释放,NICD会转移到该细胞的细胞核中并与DNA及转录因子结合,进而引起下游基因表达的变化。研究报道,骨髓基质细胞（BMSC）与造血干细胞（HSC）间的Notch1受体-配体结合会影响HSC的自我再生能力,阻碍细胞的成熟;恶性程度较高的骨肉瘤细胞具有较高的Notch1水平;Notch1的下调可以抑制宫颈癌组织的浸润、转移。在小鼠模型中,Notch1的激活可以诱发T-ALL,证明了其在白血病发病中的重要作用;同时研究表明Notch1可以调节趋化因子受体CCR7的表达,并促进T-ALL的中枢神经系统浸润。此外,我们先前曾报道Notch1/D114途径在AML细胞中被激活,并可能促进AML的疾病进展。我们还发现Notch1通路的激活可能预示着AML的不良预后。由此可见,Nocth1信号通路在多种实体肿瘤及血液系统恶性肿瘤中均发挥重要的调节功能,利用新兴的公共数据库及生物信息学分析进一步探讨Nocth1信号通路的调控网络对于理解AML的发病机理,发现新的诊断治疗靶标具有重要的临床意义。研究目的:通过下载并分析TCGA数据库中AML患者的表达谱信息及临床病理学信息,筛选出与Notch1表达相关的基因,同时筛选与AML患者危险度分层及预后相关的基因,通过交叉比对初步确定AML中与Notch1表达相关且具有临床意义的潜在分子标记物及靶点,为后期相关的功能机制研究奠定基础。研究方法:1.利用 cBioportal 工具（http://www.cbioportal.org）,下载 TCGA 数据库中 AML（非APL）相关的基因表达谱数据及临床病理学信息。2.应用R X64 3.4.1软件对数据进行批量分析,并通过Spearman检验筛选与Notch1基因表达具有相关性的基因（相关系数>0.5,P<0.05）。3.基于TCGA数据库中AML患者的危险度分层信息,利用RX64 3.4.1软件批量分析各基因与患者危险度分层的相关性,筛选与AML患者危险度分层相关的基因。4.基于基因的表达量信息,选取基因表达量的平均值,并依此将患者分为高表达、低表达两组,同时结合患者预后信息,绘制两组患者的Kaplan-Meier生存曲线。单变量COX回归分析各基因的表达与AML患者预后的相关性,筛选能够提示患者预后的基因。5.将上述2,3,4三种方法筛选出的基因进行交叉比对取交集,筛选出既与Notch1表达相关、又与患者危险度分层及预后相关的基因。研究结果:1.通过筛选TCGA AML数据库中与Notch1相关的基因,发现共有172个基因满足相关系数>0.5,P<0.05的入选条件。其中,148个基因表达与Notch1呈正相关,24个基因表达与Notch1呈负相关。2.基于TCGA数据库提供的AML患者危险度分层信息,分析发现共有17例（12.69%）处于低危组,91例（67.91%）处于中危组,26例（19.40%）处于高危组。分析各基因与危险度分层的相关性,共筛选出5,931个与AML患者危险度分层相关的基因。3.基于TCGA数据库提供的AML患者预后信息,分析各基因与患者预后的相关性,共筛选出1,584个与预后相关的基因。4.将上述三种方法筛选出的基因交叉比对并取交集,共筛选出19个与Notch1表达相关、与患者危险度分层相关、与AML患者生存总体时间相关的基因。5.进一步通过文献检索,发现共有6个基因（PACS2,PRKD2,BCL9L,SIPA1,PPM1F,RAPGEF3）可能在AML的发生发展中发挥作用,作为我们后续研究的对象。结论:通过下载TCGA数据库中AML患者基因表达谱数据及临床病理学信息数据,并利用专业软件进行批量生物信息学分析,共筛选出19个与Notch1表达相关、与AML患者危险度分层相关、与AML患者预后相关的基因。后期通过文献检索,进一步筛选出6个在AML中具有潜在功能的基因,其可能在AML的发生发展中发挥重要的调节功能,并可作为潜在的AML诊断指标和治疗靶点。第二部分PRKD2在急性髓性白血病中的功能及机制分析研究背景:急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种在遗传学和表观遗传学上高度异质性的起源于造血干/祖细胞的血液系统恶性肿瘤,其特点是骨髓造血干/祖细胞的增殖不受控制,导致未成熟的前体细胞异常积累,以及正常成熟血细胞生成不足。AML可广泛浸润肝、脾、淋巴结等多种人体重要的器官,其对机体正常造血功能的抑制将导致贫血、感染、中性粒细胞减少和血小板减少等症状,疾病进展迅速且难以控制。AML是成年人中最常见的急性白血病,近年来发病率不断上升,每100,000名成人就中有38例患病,其中位发病年龄约为66岁。根据美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）报道,2018年AML新病例数为19,520例,其中10,670人死于这种疾病。近年来,针对AML的治疗取得了一定的进展,患者的生存率得到了改善,但是目前临床广泛使用的抗白血病药物在AML的治疗方面仍令人不甚满意。年轻患者（年龄<60岁）的5年生存率仅为30-40%,而>60岁患者的5年生存率则更低,尚且不到10%。目前,AML的发病机制仍不完全明确,影响其进展的外部环境因素及内部遗传因素仍有待于进一步的探索,化疗耐药及完全缓解（complete remission,CR）后疾病复发是临床上亟待解决的重要科学问题。因此,阐明AML的发生、进展、化疗耐药及复发的机制,发现新的治疗手段,研发更为有效的抗AML药物,对于改善患者预后具有重要的价值。蛋白激酶D（protein kinase D,PRKD）家族隶属于钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶超家族,包括PRDK1,PRKD2及PRKD3,其可以被活性氧、受体酪氨酸激酶和乏氧所激活,从而调节细胞内的病理生理学过程。有研究表明PRKD2的表达可以在胃肠道间质肿瘤-内皮细胞的通信过程中充当一种重要的介质。此外,其可以在慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）中发挥重要的功能。PRKD2的表达水平及活性与淋巴瘤的分化水平相关,其可以通过激活NF-κB行使重要的调节功能。在胰腺癌及胶质瘤中,PRKD2的高表达则可以促进肿瘤细胞的生长及浸润转移能力。PRKD2参与了多种肿瘤的调控过程,然而其在AML中的作用及机制尚不明确。本课题旨在明确PRKD2在AML患者中的表达情况及其与临床病理学特征的相关性,同时在AML细胞系中验证其对AML细胞增殖及耐药的影响,以及具体的分子调节通路。本课题将为AML的基础及临床研究提供新的思路,给临床诊疗工作提供更多可参考利用的生物学靶点。研究目的:检测PRKD2基因在AML耐药及敏感细胞系中的表达水平差异,并通过体外实验验证PRKD2对AML细胞增殖、耐药的作用及分子机制。研究方法:1.利用实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测第一部分筛选出的6个基因在AML耐药及敏感细胞系中的表达差异,进一步筛选在AML进展及化疗耐药过程中可能发挥重要功能的基因。2.在AML细胞系中感染携带有PRKD2表达载体及阴性对照载体的慢病毒,加入puromycin进行筛选,建立PRKD2稳定过表达的细胞及阴性对照细胞。3.合成针对PRKD2的siRNAs及无义对照siRNAs,转染AML细胞系,下调PRKD2在细胞中的表达。4.利用qRT-PCR技术及Western blot技术检测过表达及干扰PRKD2后AML细胞中PRKD2在mRNA及蛋白水平上的表达变化。5.细胞增殖及药物敏感性检测:将过表达PRKD2的AML细胞铺于培养板中,加入CCK8检测细胞增殖速度;将过表达及干扰PRKD2的AML细胞铺于培养板中,并加入化疗药物,CCK8法检测细胞药物敏感性的改变。6.细胞凋亡的检测:利用化疗药物处理过表达及干扰PRKD2的AML细胞,采用Annexin V/PI双重染色,流式细胞术检测化疗药物诱导的细胞凋亡率的改变。7.利用实时定量PCR技术及Western blot技术,检测在AML细胞系中干扰及过表达PRKD2后,Notch1通路相关基因表达的改变。8.提取TCGA数据库中AML患者的mRNA数据信息,获得PRKD2表达量的均值,并依此将AML患者分为高表达组及低表达组,分析两组间患者临床病理学特征的差异。9.基于TCGA数据库,分析PRKD2表达联合AML常见突变对AML患者总体生存时间的影响。研究结果:1.在AML多药耐药细胞系K562/A02及亲本细胞系K562中检测第一部分筛选出的 6 个基因（PACS2,PRKD2,BCL9L,SIPA1,PPM1F,RAPGEF3）的相对表达量,发现PACS2,PRKD2,BCL9L,SIPA1,RAPGEF3这5个基因具有显著变化。其中PRKD2变化幅度最大,与药物敏感细胞系K562相比,其在耐药细胞系K562/A02中表达水平显著提高。2.应用siRNA及慢病毒转染AML细胞,qRT-PCR及Western blot检测干扰及过表达PRKD2的效率,结果表明其在mRNA水平及蛋白水平均有显著的改变。3.过表达PRKD2后细胞功能的改变:在AML细胞系KASUMI及U937中过表达PRKD2后,CCK8实验显示AML细胞的增殖速率显著提升。同时,过表达PRKD2可以降低AML细胞对化疗药物的敏感性。流式细胞术显示PRKD2表达升高后,可以显著抑制阿霉素（ADM）诱导的细胞凋亡。4.干扰PRKD2后细胞功能的改变:在AML细胞系KASUMI、U937及K562/A02中干扰PRKD2的表达,CCK8实验显示干扰PRKD2后AML细胞对化疗药物的敏感性显著增加。同时,流式细胞术显示PRKD2表达下调后ADM诱导的AML细胞的凋亡率明显升高。5.过表达及干扰PRKD2后Notch1通路相关基因的改变:实时定量PCR及Wetsern blot显示,过表达及干扰PRKD2后Notch1通路相关基因（NICD,Notch1,HES1）的表达发生相应改变,其与PRKD2的表达呈显著正相关。6.PRKD2表达量与AML患者临床病理学特征的相关性:根据AML患者PRKD2表达量的均值,共有47例患者被纳入PRKD2高表达组,87例被纳入PRKD2低表达组。分析显示,PRKD2高表达与AML患者的年龄及危险度分层情况密切相关。同时PRKD2高表达与AML常见突变（FLT3,NPMc）的发生密切相关。7.PRKD2表达联合AML常见突变对患者总体生存时间的影响:基于TCGA数据库,分析PRKD2高表达及低表达对有无AML常见突变（FLT3,IDH1,RAS,NPMc）患者预后评估的意义。结果表明,无论AML患者是否存在FLT3及NPMc突变,PRKD2高表达均提示AML患者预后不良;而对于IDH1及RAS突变,PRKD2高表达仅在不伴有该突变的AML患者中提示预后不良,具有预后判断价值。结论:我们的结果表明,PRKD2可能通过调节Notch1信号通路来促进AML细胞的增殖及化疗耐药,且分析发现PRKD2表达与患者年龄、危险度分层、基因突变等临床特征密切相关,具有良好的预后提示价值。该研究有助于我们更好的了解AML化疗耐药和增殖的具体机制,并为AML患者的临床诊疗提供新的生物学靶标。