目的脓毒症(sepsis)是儿科疾病的主要死亡原因之一,若不及时治疗可引起多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。线粒体是细胞能量生成的主要场所,脓毒症早期即可发生线粒体损伤,早期线粒体损伤是脓毒症发展为MODS的重要启动环节。因而,积极寻求有效方法保护线粒体和改善其功能是减少脓毒症严重并发症发生率和病死率的重要途径。近年来研究表明,胰岛素(insulin)除了降血糖的作用外,还有抗炎、免疫调节、减少氧化应激反应、防止内皮细胞损伤、改善血脂代谢作用、促进合成和抗细胞凋亡的等作用,这些作用的早期干预对防止脓毒症进一步发展为MODS有着重要的意义。此外,肝脏是机体进行物质和能量代谢的重要器官,并且在脓毒症早期极易受损。本课题通过观察持续胰岛素输注对脓毒症早期大鼠肝脏功能及其线粒体膜电位、形态学、氧化应激反应的影响和对血清TNF-α、IL-6、CRP水平及血糖水平、血脂代谢的影响,探讨持续胰岛素输注对脓毒症早期大鼠肝脏线粒体是否具有保护作用及其作用机制,为临床上减少脓毒症严重并发症的发生率和降低脓毒症病死率提供新的方法和思路。方法1.建立动物模型及分组脓毒症模型采用腹腔注射10mg/kg LPS建立。24只SD大鼠随机分为3组(各组大鼠在实验前1天行右颈外静脉置管术):正常对照组(n=8):腹腔注射与静脉泵注与其它两组等容量的生理盐水;LPS组(n=8):腹腔注射LPS10mg/kg,同时持续泵注生理盐水1ml/h;胰岛素干预组(n=8):腹腔注射LPS10mg/kg,同时持续泵注胰岛素生理盐水溶液1ml/h,胰岛素用量为0.25U/kg/h。2.检测指标及方法(1)大鼠一般情况:①观察注射LPS前20min及注射后2h、6h、12h和24h的肛温、心率和呼吸频率。②运用快速血糖仪检测上述各时点的血糖水平(BG)。(2)大鼠炎症反应指标:①运用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测注射LPS后2h、6h的大鼠血清TNF-α和IL-6的浓度和24h的大鼠血清CRP的浓度。(3)大鼠生化指标:①肝功能指标:运用全自动生化分析仪检测注射LPS后24h的大鼠血清ALT和AST水平。②脂代谢指标:运用全自动生化分析仪检测注射LPS后24h的大鼠血清TG、HDL和LDL水平。(4)大鼠肝脏粒体损伤相关指标:①采用差速离心法提取大鼠肝脏线粒体,JC-1染料染色,流式细胞仪检测线粒体肿胀程度和线粒体膜电位。②运用比色法检测大鼠肝脏线粒体氧化应激相关指标(SOD、MDA)。③电镜观察大鼠肝脏线粒体损伤状况,按照Flameng分级方法对线粒体进行半定量评分。3.统计方法获得的数据SPSS13.0统计软件分析,结果用均值±标准差(±s)表示;多组间比较采用单因素方差分析,在多样本均数比较差异具有统计学意义时进行均数两两比较,方差齐性者采用LSD法分析组间差异,方差不齐者采用Games-Howell法分析组间差异;重复测量资料采用重复测量方差分析;相关分析采用Pearson进行检验;α值界定为0.05。结果1.动物一般情况:LPS组和胰岛素干预组均出现脓毒症相关症状体征。与正常对照组相比,LPS组各监测时点血糖水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,胰岛素干预组各监测时点血糖水平显著下降(P<0.05)。2.大鼠炎症反应指标:(1)各组大鼠血清TNF-α和IL-6水平的比较腹腔注射LPS后2h和6h,与正常对照组相比,LPS组和胰岛素干预组大鼠血清TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,胰岛素干预组大鼠血清TNF-α和IL-6水平显著降低(P<0.05)。(2)各组大鼠血清C-反应蛋白水平的比较腹腔注射LPS后24h,与正常对照组相比,LPS组和胰岛素干预组大鼠血清CRP水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,胰岛素干预组大鼠血清CRP无显著改变(P>0.05)。3.大鼠生化指标:(1)各组大鼠血清ALT和AST水平的比较腹腔注射LPS后24h,与正常对照组相比,LPS组和胰岛素干预组大鼠血清ALT和AST水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,胰岛素干预组大鼠血清ALT和AST水平显著下降(P<0.05)。(2)各组大鼠血清TG、HDL和LDL水平的比较腹腔注射LPS后24h,与正常对照组相比,LPS组和胰岛素干预组大鼠血清TG、HDL和LDL水平均无显著改变(P>0.05);与LPS组相比,胰岛素干预组大鼠血清TG和HDL水平改变不显著(P>0.05),而LDL水平则显著上升(P<0.05)。4.大鼠肝脏线粒体指标(1)各组大鼠肝脏线粒体肿胀程度和膜电位的比较腹腔注射LPS后24h,各组大鼠间肝脏线粒体肿胀程度的比较差异无统计学意义(P>0.05)。腹腔注射LPS后24h,与正常对照组相比,LPS组和胰岛素干预组肝脏线粒体膜电位显著下降(P<0.05);而胰岛素干预组肝脏线粒体膜电位与LPS组相比则显著上升(P<0.05)。(2)各组大鼠肝脏线粒体SOD、MDA水平的比较腹腔注射LPS后24h,与正常对照组相比,LPS组和胰岛素干预组肝脏线粒体SOD水平显著升高(P<0.05);而胰岛素干预组与内毒素血症组相比,肝脏线粒体SOD水平则显著降低(P<0.05);各组大鼠肝脏线粒体MDA水平则无显著差异(P>0.05)。(3)各组大鼠肝脏线粒体电镜观察及半定量分析腹腔注射LPS后24h,各组大鼠肝脏线粒体电镜观察改变不明显,半定量分析无显著差异(P>0.05)。5.大鼠肝脏线粒体膜电位与其他指标的相关性分析大鼠肝脏线粒体膜电位与血清ALT和AST水平呈负相关(r=-0.869,P<0.05;r=-0.846,P<0.05)。大鼠肝脏线粒体膜电位与血清TG、HDL和LDL水平均无显著的相关关系(r=-0.309,P>0.05;r=0.209,P>0.05;r=0.264,P>0.05)。大鼠肝脏线粒体膜电位与腹腔注射LPS后6h大鼠血清TNF-α、IL-6水平呈负相关(r=-0.879,P<0.05;r=-0.900,P<0.05)。大鼠肝脏线粒体膜电位与腹腔注射LPS后6h和12h大鼠血糖水平呈负相关(r=-0.696,P<0.05;r=-0.744,P<0.05)。结论1.脓毒症早期存在肝脏功能损伤,这种功能性损伤与线粒体功能损伤相关。2.脓毒症早期肝脏线粒体功能已经明显损伤,而其结构尚未发生明显改变;脓毒症早期肝脏线粒体损伤具有可逆性,脓毒症时肝脏线粒体的保护关键在于早期治疗。3.持续胰岛素输注对脓毒症早期大鼠肝脏线粒体有明显的保护作用,此保护作用与其降低过高的血糖水平、减轻氧化应激损伤和减轻过度的炎症反应有关,而与脓毒症早期血脂代谢无明显相关。