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目的：构建由人端粒酶逆转录酶基因启动子调控复制、分别携带自杀基因CD或HSV-1TK的新型腺病毒载体,观察该病毒载体在端粒酶阳性肿瘤细胞中的复制能力,并进一步深入研究该载体与自杀基因/前药系统(CD/5-FC,HSV-1TK/GCV)结合后,在体内体外实验中对肿瘤的杀伤作用.为肿瘤基因治疗提供一个新的方法.
方法：在人端粒酶逆转录酶基因启动子调控E1A表达的条件复制型腺病毒载体的基础上,分离CD及HSV-1TK基因表达盒,并插入上述条件复制型腺病毒载体的E1A基因表达盒下游,构建两个新的条件复制型腺病毒载体Ad.hTERT-E1A-CD和Ad.hTERT-E1A-TK.通过与腺病毒基因组DNA共转染人胚肾293细胞 (HEK293)后,成功包装出重组腺病毒颗粒.然后经过筛选、扩增和密度梯度离心,制备出纯化的腺病毒.并以野生型腺病毒d1309和复制缺陷型腺病毒Ad.GFP作为对照,对该病毒在端粒酶活性很低或阴性的原代培养的成纤维细胞和端粒酶活性很高或阳性的肿瘤细胞(包括NCIH460、HeLa、SW1990)中的复制能力进行了观察.并通过CCK-8显色评估Ad.hTERT-E1A-CD和Ad.hTET-E1A-TK本身,或联合CD/5-FC、HSV-1TK/GCV自杀基因/前药系统后,对体外培养的NCIH460、A549和HeLa等肿瘤细胞的杀伤效果.然后,建立人肺癌裸鼠模型,进一步研究病毒结合自杀基因/前药系统在体内对肿瘤生长的抑制作用.
结果：
1.重组腺病毒载体在正常和肿瘤细胞中的复制情况Ad.hTERT-EIA-CD及Ad.hTERT-EIA-TK能选择性的在肿瘤细胞内复制,复制效率与d1309类似,而在正常的原代成纤维细胞中不复制.
2.体外对肿瘤细胞的杀伤试验(1)Ad.hTERT-ElA-CD治疗组: Ad.hTERT-ElA-CD单独使用,或与CD/5-FC自杀基因/前药系统联合后,NCIH460细胞的存活率分别为20.15﹪和1.24﹪；A549细胞的存活率分别为30.13﹪和1.65﹪；HeLa细胞的存活率分别为15.43﹪和0.54﹪.(2)Ad.TERT-EIA-TK治疗组:Ad.TERT-ElA-TK、单独使用,或与HSV-lTK/GCV自杀基因/前药系统联合后,NCIH460细胞的存活率分别为31.12﹪和1.81﹪；A549细胞的存活率分别为25.43﹪和2.24﹪；HeLa细胞的存活率分别为15.87﹪和0.94﹪.
以上结果表明,Ad.hTERT-EIA-CD和Ad.hTERT-E1A-TK对肿瘤细胞有杀伤作用,CD/5-FC和HSV-1TK/GCV自杀基因/前药系统增加了病毒杀伤肿瘤细胞的效果.(1).Ad.hTERT-E1A-CD治疗情况肿瘤生长曲线显示:从治疗开始后的第8天起,单独注射Ad.hTERT-E1A-CD组,Ad.hTERT-EIA-CD与5-FC联合治疗组,与PBS、PBS+5-FC及Ad.null组相比,肿瘤生长减慢.其中Ad.hTERT-E1A-CD与5-FC联合组,肿瘤生长更趋缓慢.
治疗结束时,PBS、PBS+5-FC、Ad.null、Ad.hTERT-E1A-CD、Ad.hTERT-EIA-CD与5-FC联合治疗组,裸鼠移植瘤体积分别为:2488.80±468.97mm<3>、2261.00±362.87mm<3>、 2440.00±227.99mm<3>、993.01±317.62mm<3>、326.80±236.66mm<3>.统计分析揭示,单独注射Ad.hTERT-EIA-CD组,Ad.hTERT-EIA-CD与5-FC联合应用组,与仅注射PBS的对照组比较,裸鼠移植瘤体积明显较小(p=0.006:p=0.001).而单独注射复制缺陷型腺病毒Ad.null组,与腹腔注射前药5-FC组或PBS的对照组相比较,裸鼠移植瘤体积差异不明显(p=1.000:p=0.995).Ad.hTERT-EIA-CD联合5-FC组与单独注射Ad.hTERT-E1A-CD组相比,裸鼠移植瘤体积更小(p=0.032).
处死小鼠后剥离肿瘤,称取肿瘤的重量.与PBS组比较,Ad.hTERT-E1A-CD与5-FC联合治疗组及Ad.hTERT-EIA-CD单独治疗组,肿瘤抑制率分别为80.5﹪和57.6﹪.Ad.hTERT-E1A-CD联合5-FC治疗组和单独注射Ad.hTERT-EIA-CD治疗组相比,肿瘤抑制率达54.1﹪.病理切片发现肿瘤经过Ad.hTERT-E1A-CD治疗后,肿瘤内有广泛的坏死,尤其与CD/5-FC联合使用后,坏死区域更加广泛.对照组病理切片无明显坏死区域.(2) Ad.hTERT-E1A-TK治疗情况肿瘤生长曲线显示:从治疗开始后的第8天起,单独注射Ad.hTERT-EIA-TK以及Ad.hTERT-EIA-TK与GCV联合治疗组,与对照组相比,肿瘤生长减慢.第16天时,Ad.hTERT-E1A-TK与GCV联合治疗组,肿瘤生长比Ad.hTERT-E1A-TK组更趋缓慢.
治疗结束时,PBS+GCV、Ad.hTERT-E1A-TK、Ad.hTERT-EIA-TK与GCV联合治疗组,肿瘤体积分别为:2287.00±399.24mm<3>、1274.50±325.47mm<3>和435.01±34.16mm<3>.单独用Ad.hTERT-E1A-TK以及Ad.hTERT-EIA-TK与GCV联合组,与对照组比较,裸鼠肿瘤体积明显较dx(p=0.025；p=0.008).其中,Ad.hTERT-E1A-TK联合GCV治疗组与Ad.hTERT-E1A-TK单独治疗组相比肿瘤体积更小(p=0.040).
实验结束后处死小鼠,剥离肿瘤后称取瘤重.与对照组比较,Ad.hTERT-E1A-TK与GCV联合治疗组和Ad.hTERT-E1A-TK单独治疗组,肿瘤抑制率为74.34﹪和154.39﹪.mAd.hTERT-E1A-TK联合GCV治疗组与单独注射Ad.hTERT-E1A-TK相比,肿瘤抑制率达43.75﹪.提示复制型腺病毒Ad.hTERT-E1A-TK单独使用就产生了明显的肿瘤生长抑制作用,当与前药GCV联合使用后,抑制肿瘤生长的作用明显增强.结论:我们成功的构建了由人端粒酶逆转录酶基因启动子调控的、可介导自杀基因CD或HSV-1TK转移和表达的复制型腺病毒载体Ad.hTERT-ElA-CD及Ad.hTERT-ElA-TK.该病毒可以在端粒酶阳性的肿瘤细胞中复制,并杀伤肿瘤细胞,而在端粒酶阴性的原代成纤维细胞中不复制,具有很好的肿瘤细胞选择性.体内外试验表明,当病毒与CD/5-FC或HSV-lTK/GCV自杀基因/前药系统结合时,杀伤肿瘤细胞的能力得到提高.Ad.hTERT-ElA-CD、Ad.hTERT-ElA-TK结合了病毒一基因治疗的优点,具有良好的应用前景.