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瘤胃上皮的免疫功能对维持奶牛的生理健康非常重要。给奶牛长时间饲喂高精料日粮会使瘤胃内细菌大量死亡并产生细菌小肽,细菌小肽会诱发瘤胃炎症以及引起全身炎症反应,导致重大损失。寡肽转运体POTs家族中溶质载体15A4（Solute carrier family 15A4,SLC15A4（PHT1））在瘤胃中表达量最高,它是一种利用膜内外电位差介导物质转运的细胞转运膜蛋白。SLC15A4主要位于细胞膜上,负责将二/三肽和拟肽类物质从胞外转运至细胞质中,对维持瘤胃内短链肽的平衡具有重要的作用。细菌胞壁酰二肽（MDP）是所有细菌共有的具有生物活性的最小肽聚糖基序,能够被细胞质中NOD2受体识别,激活NF-κB等信号通路,促使细胞炎症因子的释放。有研究证明,SLC15A4能够识别MDP为底物,且能转运和吸收MDP。然而,SLC15A4能否介导MDP调控奶牛瘤胃上皮细胞（BREC）的免疫反应还未有研究。因此,本试验通过CRISPR/Cas9基因编辑技术来研究SLC15A4基因调控奶牛瘤胃上皮细胞免疫反应的分子机制,为研究反刍动物瘤胃免疫应答提供理论依据。试验结果如下:1.CRISPR/Cas9系统建立奶牛瘤胃上皮细胞SLC15A4基因敲除细胞系。结果表明:（1）以野生型BREC基因组为模板,PCR产物经凝胶电泳后得到386 bp的目的条带,这与测序结果一致。表明SLC15A4在野生型BREC基因组中存在。（2）成功构建 LentiCRISPRv2-sgRNA 载体。sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3 和 sgRNA4 序列均正确插入lentiCRISPRv2,插入序列的位置、方向及序列均与预期相符。（3）sgRNA2对BREC SLC15A4第二外显子区有切割活性。SLC15A4 CX上游引物和下游引物的测序结果显示,均从靶点sgRNA-2处开始出现套峰。这表明LentiCRISPRv2-sgRNA2载体成功转入BREC中,并造成SLC15A4基因碱基的插入或缺失。（4）单克隆的BREC在靶点sgRNA2处插入一个碱基T。测序和TA克隆测序峰图显示,此次敲除为纯合敲除。由于不是3的倍数的碱基插入,并且在插入下游造成移码突变,致使终止密码子TAG在816号碱基处提前出现,造成蛋白序列或空间构象的改变,因此认定该细胞为成功的敲除细胞系。2.转录组分析SLC15A4敲除对BREC差异mRNA表达的影响。结果表明:（1）SLC15A4敲除后会影响BREC中多条信号通路,并且对BREC的转运功能产生影响。（2）敲除SLC15A4后,BREC中IL-6和IL-8的表达量极显著下调（P＜0.001）。IL-1β、IL-32和TNF-a的表达量也是呈下调的趋势。（3）敲除SLC15A4后,趋化因子总体趋势是下调的,其中CCL2、CCL5和CXCL8被极显著下调（P＜0.001）。而 CCL28、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL9 和 CXCL12 与野生型 BREC 相比表达量显著下降（P＜0.05）。（4）敲除SLC15A4后,NF-κB信号通路中NF-κB抑制子激酶（IKKB、IKKE）和 NF-κB 抑制子（IKBA、IKBB、IKBD、IKBE 和IKBZ）均未发生明显变化。然而NF-κB转录因子家族的5个成员中,有四个（NF-κB1、NF-κB2、RELA和RELB）的表达量均发生显著下调（P＜0.05）。（5）敲除SLC15A4后,NOD1和NOD2均被极显著下调（P＜0.001）。同时NOD受体信号通路下游的关键激酶RIPK1、RIPK2和RIPK3也明显下调（P＜0.05）。（6）敲除SLC15A4后BREC Toll受体信号通路中的接头蛋白TLR2、TLR3、TLR4和MYD88显著上调（P＜0.05）。TNF受体相关因子中TRAF3显著上调（P＜0.05）,TRAF6则无影响。IL-1受体相关激酶中IRAK1和IRAK2均显著上调（P＜0.05）。（7）敲除SLC15A4后BREC中MAPK信号通路中ERK激酶的ERK2显著上调,ERK1和ERK8显著下调（P＜0.05）。JNK激酶中JNK1和JNK3显著上调（P＜0.05）。p38 激酶中 p38β、p38γ 和 p38α 显著上调（P＜0.05）。（8）qRT-PCR验证结果显示,与 WT 组相比,SLC15A4 KO 组 IL-6、CXCL2、CXCL3、CXCL9、CCL2、CCL5、NOD1、NOD2和RIPK2表达量被显著下调（P＜0.05）,TNF-α表达量没有差异,这与转录组分析的结果一致。以上结果表明,SLC15A4敲除后会影响BREC免疫反应中MAPK、Toll、NOD-RIPK、NF-κB信号通路以及促炎因子和趋化因子的表达。3.SLC15A4介导细菌二肽MDP调控奶牛瘤胃上皮细胞免疫反应。试验分为3组:野生型BREC（WT）;添加10 μg/mLMDP野生型BREC（WT+MDP）;添加 10 μg/mL MDP 敲除型 BREC（SLC15A4 KO+MDP）。结果表明:（1）MDP 可以显著提高 BREC 中 IL-6、TNF-α、CXCL2、CXCL3、CXCL9、CCL2 和 CCL5 的表达量。SLC15A4 敲除后,由 MDP 诱发的 IL-6、TNF-α、CXCL2、CXCL3、CXCL9、CCL2和CCL5的表达量显著下降（P＜0.05）。（2）MDP可以显著提高BREC中NOD-RIPK通路的表达量（P＜0.05）。ERK1/2、p65、p-ERK1/2和p-p65激酶表达量在MDP加入后被显著上调。SLC15A4敲除后,由MDP诱发的NOD-RIPK通路的表达量减少,同时ERK1/2、p65、p-ERK1/2和p-p65激酶的表达被显著抑制。这表明,SLC15A4敲除后由MDP激活的NOD-RIPK通路、NF-κB通路和MAPK通路被显著抑制。结论:SLC15A4可以介导MDP调控BREC中NOD-RIPK通路来调控NF-κB通路和MAPK通路,进而影响炎症因子和趋化因子的表达,从而调控BREC的免疫反应。