Gasdermin D（GSDMD）是Gasdermin家族成员之一,在胃肠道及其它多种组织或细胞中广泛表达。2015年研究报道指出,GSDMD是炎性体这一天然模式识别信号的下游关键接点分子。GSDMD被半胱天冬酶（Caspases）剪切后产生GSDMD-N末端,GSDMD-N具有与生物膜结合并介导生物膜打孔的特性,从而引起细胞焦亡,促进IL-1β和IL-18的释放。目前,关于GSDMD生物学功能的报道主要集中在细胞焦亡。然而,GSDMD是否参与到调节肠道黏膜屏障功能并不清楚。鼠伤寒沙门菌（本文简称沙门菌）是重要的人兽共患肠道病原菌,具有高致病率、致死率和流行范围广的特性,严重威胁人类健康,阻碍畜牧养殖业发展。天然免疫是阻止病原菌入侵的第一道防线,研究调节肠道黏膜免疫反应的分子机制,以找到干预靶标,有助于沙门菌感染性肠炎的防控。本论文对GSDMD在宿主防御沙门菌黏膜感染中的作用和机制进行了探讨。本研究首先通过构建野生型（WT）和GSDMD基因缺失型(GSDMD^-/-)小鼠沙门菌肠炎模型,分析了GSDMD在沙门菌感染中的作用。与WT小鼠相比,GSDMD^-/-小鼠更为易感,主要表现为小鼠体重减轻更为明显、存活率显著降低;并且,在感染48 h后,盲肠重量减轻、肠上皮完整性破坏、黏膜下层水肿、杯状细胞减少等肠道病理损伤特征更加显著。沙门菌经消化道进入宿主体内后,在肠道局部大量定殖,随后突破肠道黏膜屏障并扩散到系统位点,引起宿主的胃肠炎及全身性感染。研究发现在感染沙门菌48 h后,GSDMD^-/-小鼠盲肠组织、粪便、肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏沙门菌定殖量显著高于WT小鼠。上述结果表明,GSDMD有助于机体抵抗沙门菌黏膜感染。肠黏膜屏障功能的完整性有利于防御肠道病原入侵和扩散。为了揭示GSDMD限制沙门菌黏膜感染表型的机制,本实验分析了GSDMD对肠黏膜物理屏障、化学屏障以及炎症反应的影响。在感染48 h后,GSDMD^-/-小鼠肠黏膜的炎性细胞浸润以及多种炎性介质产生均显著高于WT小鼠,仅IFN-γ低于WT小鼠（P<0.05）。为了分析GSDMD是否影响肠黏膜物理屏障和化学屏障,应用免疫荧光和TUNEL染色检测了盲肠组织肠上皮细胞的增殖与凋亡情况,应用免疫荧光检测了盲肠组织中紧密连接蛋白claudin-3的表达情况,以及通过免疫组织化学和AB-PAS染色方法检测盲肠组织中黏蛋白的表达情况。与WT小鼠相比,在感染48 h后,GSDMD^-/-小鼠上皮细胞的增殖明显减少,凋亡明显增加,claudin-3的表达显著减少,以及黏蛋白和mucin 2表达显著减少,但两种基因型小鼠在未感染前,上皮细胞增殖和凋亡、claudin-3、黏蛋白和mucin 2表达均并无明显差异。以上结果说明GSDMD^-/-小鼠感染沙门菌后,肠黏膜的完整性破坏更加严重。然而,这些结果并不能说明炎症加剧、肠道黏膜屏障受损与沙门菌定殖、扩散增多之间的因果关系。因此,设计了两种基因型小鼠的沙门菌急性感染实验,对比分析细菌定殖、炎症反应、物理化学屏障功能。在沙门菌感染6 h后,两种基因型小鼠并无明显肠炎症状,且黏蛋白、claudin-3以及细胞的增殖与凋亡无明显差异,然而,与WT小鼠相比,GSDMD^-/-小鼠粪便中细菌定殖数量显著增加（P<0.05）。由此说明,GSDMD主要通过限制沙门菌在肠腔的早期定殖,达到抑制沙门菌肠道感染的作用。GSDMD如何限制沙门菌在肠腔的早期定殖?本研究对此作了进一步分析。如前所述,在感染48 h后,GSDMD^-/-小鼠肠黏膜IFN-γ显著低于WT小鼠。而IFN-γ具有抑制病原菌增殖的功能,其主要由自然杀伤（NK）细胞,固有淋巴细胞和T细胞产生,IL-18是诱导其分泌的重要因素;并且,在炎性体活化信号的作用下,GSDMD能介导IL-18的释放。基于这些原因,本研究分析了感染过程中IL-18和IFN-γ的动态表达。结果发现:正常情况下,WT与GSDMD^-/-小鼠IL-18和IFN-γ表达无差异;而链霉素处理及沙门菌感染后,WT小鼠中IL-18和IFN-γ显著高于GSDMD^-/-小鼠。据此推测:GSDMD^-/-小鼠IL-18和IFN-γ的产生减少可能是导致沙门菌扩散增加和易感性增加的原因。因此,我们回补了IL-18和IFN-γ重组蛋白,感染48 h后采集组织,发现回补重组蛋白后,GSDMD^-/-小鼠病理损伤及沙门菌组织定殖均明显改善,尤其在限制沙门菌肠腔定殖方面作用明显（P<0.001）。因此,IL-18和IFN-γ是GSDMD抑制沙门菌肠腔定殖的重要效应分子。由于IL-18和IFN-γ的诱导产生主要体现于链霉素处理后,而在沙门菌感染6 h并无明显的诱导效应,推测IL-18和IFN-γ的产生可能主要源于肠道菌的刺激,并且链霉素处理后两种基因型小鼠IL-18和IFN-γ存在差异,也可能源于两种基因型小鼠存在肠道菌差异。为了验证该假设,通过定量PCR和16S rRNA测序检测两种基因型小鼠肠道菌群组成。结果表明,链霉素处理后,GSDMD^-/-小鼠肠道菌群与WT小鼠明显不同。将两种基因型小鼠进行共同饲养,两种基因型小鼠肠道菌群趋于相似,并且共饲后GSDMD^-/-与WT小鼠对沙门菌易感性一致,尤其是两种基因型小鼠的IL-18和IFN-γ的表达差异在共饲后消失。应用复合抗生素对两种基因型小鼠的肠道菌进行清除,沙门菌在WT和GSDMD^-/-小鼠的肠腔定殖也不再体现差异;并且,将来源于链霉素处理后的WT和GSDMD^-/-小鼠菌群分别移植到WT小鼠中,移植了GSDMD^-/-小鼠菌群的WT小鼠(GSDMD^-/--strep→WT),其粪便及盲肠沙门菌定殖量明显多于WT小鼠菌群移植组（WT-strep→WT）。与共饲条件下相似,未感染沙门菌前,两种基因型小鼠的IL-18和IFN-γ表达差异在菌群清除条件下也消失;并且在GSDMD^-/--strep→WT菌群移植小鼠的IL-18和IFN-γ水平比WT-strep→WT菌群移植小鼠低。上述结果表明,GSDMD形成特定的肠道菌群,该菌群能诱导IL-18和IFN-γ的生成,从而限制沙门菌在肠腔定殖。综上所述,本论文研究揭示了GSDMD可能通过塑造特定的肠道菌群,诱导IL-18&IFN-γ的产生,限制沙门菌的肠腔定殖,从而实现其抗感染保护作用。