黄酮类化合物是植物颜色的重要来源,其属于多酚类次级代谢产物,普遍存在于植物界中。按照其C环氧化程度和黄酮骨架的取代形式,能够分为二氢黄酮、黄酮、二氢黄酮醇、黄酮醇、黄烷酮和花青素等。黄酮类化合物可以帮助植物应对非生物和生物胁迫,例如防止由于紫外照射引起的组织损伤、适应缺水条件和防止微生物的侵袭等。临床研究发现,黄酮类化合物还具有相当重要的营养和药用价值。黄酮类化合物在高等植物中分布非常普遍,而且在一些原始类群中也有报道,例如苔类植物和楔叶类植物。处于不同进化地位的植物含有的黄酮类型有很大不同,随着进化地位的提高植物体内所含的黄酮结构复杂程度也越高。高等植物中的诸多研究已经表明,黄酮类化合物生物合成途径来自于苯丙烷和丙二酸生物合成途径。在这个过程中,有四个2-氧酮戊二酸/Fe2+依赖的双加氧酶(2-ODD)参与,分别为黄酮合成酶Ⅰ(FNSI)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、黄酮醇合成酶(FLS)和花青素合成酶(ANS)。在以前的研究中,研究者克隆并鉴定了一些伞形科植物的FNSI基因,并提出伞形科的FNSI是由其F3H基因复制而来。近些年在其他植物中FNSI也偶有报道,包括处于较低进化地位的苔类植物。F3H在黄酮生物合成过程中处于黄酮醇和花青素合成的关键位置,在被子植物中广泛分布,但是在进化早期的植物中,却很少有关子F3H的报道。并且,尽管在卷柏和小立碗藓体内能检测到二氢黄酮醇衍生物的存在,但是根据生物信息学分析,在他们的植物体内并没有F3H同源基因的存在。所以,关于F3H在早期植物中的进化过程成了一个未解之谜。本实验室前期从钝鳞紫背苔中克隆并鉴定了一个黄酮合成酶:PaFNSI。它可以催化二氢黄酮生成2-羟基二氢黄酮和黄酮。序列比对结果表明,PaFNSI与F3H序列相似性高于与伞形科植物FNSI序列相似性。能催化生成2-位羟基产物及与F3H较高的相似性,提示PaFNSI与F3H存在可能的进化关系。然而由于缺少苔藓和蕨类的相关FNSI和F3H基因信息,对于这两者之间在早期植物中的进化关系在本文研究之前尚无相关报道。在本研究中,以 PaFNSI 搜索钝鳞紫背苔Plagiochasma appendiculatum(SRP073827)、粗裂地钱Marchantia paleacea(SRP078650)、楔瓣地钱Marchantia emarginata(SRP078649)、蛇苔 Conocephalum conicum(SRP076966)和小蛇苔 Conocephalum japonicum(SRP078647)的五个转录组数据库,得到PaFNSI在苔类植物中的八个同源基因,分别命名为:PaFNSI2,PaFNSI3,MpFNSI2,MpFNSI3,MeFNSI2,CcFNSI1,CjFNSI1和CjFNSI2。此外,当使用代表2-氧酮戊二酸/Fe2+家族特征的 Pfam 号 PF03171(http://pfam.xfam.org/)去搜索小立碗藓(Physcomitrella patens)和卷柏(Selaginella 的基因组数据库,发现了九个与F3H同源的基因,分别命名为 PpF3H,PpF3H-1,PpF3H-2,SmF3H,SmF3H-A,SmF3H-B,SmF3H-C,SmF3H-D和SmF3H-E。本研究还结合不同进化地位植物中的F3H和FNSI,包括裸子植物(云杉、冷杉和银杏)和被子植物(无油樟、拟南芥和苜蓿)中的F3H基因以及伞形科欧芹的PcFNSI进行了研究。序列比对结果表明,苔类的FNSIs都具有与2-OG和Fe2+结合的关键氨基酸。进化树分析结果显示,苔类的FNSIs、小立碗藓和卷柏中的F3Hs与前期研究的PaFNSI聚在一起,位于F3H/FNSI和FLS/ANS这两大分支之间。我们从植物中克隆出苔类、小立碗藓、卷柏、拟南芥和苜蓿的基因,并由金唯智公司合成了云杉、冷杉、银杏和无油樟的基因。将这些基因构建原核表达载体,IPTG诱导表达蛋白后,用镍离子亲和层析的方法纯化蛋白,进行体外酶活功能鉴定。体外酶活结果结合进化树分析结果表明,FNSI在苔类植物中是普遍存在的,并且分为两类。一类是具有双功能,能催化二氢黄酮生成2-羟基二氢黄酮和黄酮;另一类是只有单功能,只能催化二氢黄酮生成黄酮而不能生成2-位羟基化产物。此外,本研究中涉及的苔类FNSIs还都表现出比较强的FLS活性。本研究说明FNSI在植物界比F3H出现的早。在小立碗藓和卷柏中,有功能的基因为FNSI和F3H的双重催化活性,而在裸子植物中,所研究的基因主要具有F3H活性,带有微弱的FNSI活性。伞形科欧芹的PcFNSI能够催化柚皮素生成芹菜素,也表现出微弱的FLS活性,能够催化二氢山奈酚生成少量的山奈酚。这些生化功能结合进化树分析结果表明,在植物体内(从苔藓到被子植物),F3H可能是经由典型的FNSI,到FNSI/F2H过渡态,再到FNSI/F3H过渡态,最后到典型的F3H进化而来。为了研究与2-位羟基化产物形成有关的结构域和关键氨基酸,对来自小蛇苔的双功能CjFNSI 1和单功能CjFNSI 2分别进行了结构域互换和点突变。发现CjFNSI 1的C端是决定2-位羟基化产物形成的结构域,单点突变并不能使CjFNSI 1和CjFNSI 2的功能发生逆转性的变化,CjFNSI 1五点同时突变得不到可溶蛋白,说明这些氨基酸共同作用,使得蛋白正常表达并发挥作用,产生2-羟基产物。CjFNSI 2五点同时突变不能产生2-羟基产物。在所研究的苔类中,没有发现有催化功能的F3H。