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背景和目的：
原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一类我国高发病率、高死亡率的恶性肿瘤，给我国人民健康造成了极大负担。门静脉癌栓(PVTT)是肝癌中一种常见的转移形式之一，给肝癌治疗带来极大的困难。DNA甲基化异常是肿瘤发生发展的关键机制之一，因其稳定且可以伴随疾病发展或治疗而变化，是一个潜在的理想生物标志物。本研究通过全DNA甲基化分析对门静脉癌栓特征进行分析，探索门静脉癌栓中可能存在的关键分子事件，并重点分析了DNAH17和ADRA1A两个基因在肝细胞肝癌中甲基化改变情况。
实验方法：
利用InfiniumHumanMethylation450芯片(病人数=11)对邻近正常组织(ANT)、HCC组织和PVTTs进行全基因组DNA甲基化分析。通过MTS实验和凋亡实验，以评估地西他滨(DAC )和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rh-TRAIL)对肝癌细胞系抑制的协同作用。在对DNAH17的研究中，主要使用SequenomEpiTYPER法评估了163个HCC样本及其配对正常组织中DNAH17的甲基化水平，并利用TaqMan拷贝数试剂盒分析来评估DNAH17在样本中的拷贝数状态。同时结合免疫组化、qPCR等验证该基因该肝癌中的表达差异。对ADRA1A的研究中，同样使用了SequenomEpiTYPER对分析了160个HCC患者中该基因的甲基化水平。通过构建稳转细胞系、免疫组化、转录组测序等方法，探索该基因在肝脏中潜在作用机制。
实验结果：
1、HCC组织和PVTTs的整体平均甲基化水平明显低于ANT(P＜0.01)。在HCC组织和配对的PVTTs之间共鉴定532个差异基因中864个差异甲基化CpG位点(平均甲基化差异＞10%，P＜0.005)。基于PVTT组织中高甲基化基因的KEGG通路分析显著富集于肌动蛋白细胞骨架调控通路(P=4.48E-5)。23个基因的甲基化水平在HCC和PVTT中呈梯度变化，其中17个基因的甲基化水平梯度升高(例如，PAK1、NDRG2、SLC9A3R2、ZC3H3)和6个基因梯度降低(ADORA2A、KIAA1143、NAPEPLD、PARVG、TNFRSF10A、TSTD1)。TNFRSF10A是TRAIL的关键细胞表面受体之一，可被rh-TRAIL激活。MTS实验和细胞凋亡实验表明，DAC和rh-TRAIL联合使用可协同抑制SK-Hep-1和Huh7细胞系的增殖以及诱导凋亡。
2、与ANT相比，肝癌组织的DNAH17平均甲基化水平显著降低(扩增子1:58.7%vs.84.5%(癌vs.癌旁)，P＜0.0001;扩增子2:69.9%vs.84.5%(癌vs.癌旁)，P=0.0060)。RNA-seq和免疫组化均显示肿瘤组织中DNAH17表达增加(P＜0.05)。DNMT抑制剂处理肝癌细胞可发现DNAH17表达上调。DNAH17基因扩增常和低甲基化状态并存。还发现低甲基化状态与男性患者、较高的AFP值、高龄、存在完整包膜、存在肿瘤坏死、肝硬化、肝癌癌栓等临床特征相关(P＜0.05)。ROC曲线分析显示，DNAH17的甲基化水平可以有效预测肝癌包膜(AUC=0.695)和肝癌癌栓(AUC=0.806)的存在。
3、ADRA1AmRNA水平和蛋白水平在肝癌组织中的表达水平明显降低。与ANT相比，160例肝癌患者的肿瘤组织中ADRA1A启动子区域的平均甲基化水平显著升高(25.2%：17.0%，P＜0.0001)。地西他滨作用肝癌细胞系，可以增加肝癌细胞系中ADRA1A的表达。此外，肝癌样本中ADRA1A基因的高甲基化水平与酒精摄入(P=0.0097)和甲胎蛋白(P=0.0411)存在明显相关性。ROC曲线分析显示，ADRA1A的平均甲基化水平可以区分HCC组织与癌旁非癌组织(AUC=0.700,P＜0.0001)。通过构建ADRA1A稳定敲减的肝癌细胞系的转录组测序结果显示，主要富集途径为癌通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和代谢通路(P＜0.01)。
结论：
我们的研究表明，DNA甲基化通过调节转移相关的途径在PVTT的形成中发挥重要作用。DAC与rh-TRAIL联合应用可能是一种有前景的HCC治疗策略。DNAH17的异常甲基化与肝癌的多种临床病理特点有关，可能是肝癌患者肿瘤血栓形成的一个有潜在应用价值的生物标志物。ADRA1A基因异常高甲基化可能参与HCC的发生，同样有可能作为HCC诊断的生物标志物。
原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一类我国高发病率、高死亡率的恶性肿瘤，给我国人民健康造成了极大负担。门静脉癌栓(PVTT)是肝癌中一种常见的转移形式之一，给肝癌治疗带来极大的困难。DNA甲基化异常是肿瘤发生发展的关键机制之一，因其稳定且可以伴随疾病发展或治疗而变化，是一个潜在的理想生物标志物。本研究通过全DNA甲基化分析对门静脉癌栓特征进行分析，探索门静脉癌栓中可能存在的关键分子事件，并重点分析了DNAH17和ADRA1A两个基因在肝细胞肝癌中甲基化改变情况。
实验方法：
利用InfiniumHumanMethylation450芯片(病人数=11)对邻近正常组织(ANT)、HCC组织和PVTTs进行全基因组DNA甲基化分析。通过MTS实验和凋亡实验，以评估地西他滨(DAC )和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(rh-TRAIL)对肝癌细胞系抑制的协同作用。在对DNAH17的研究中，主要使用SequenomEpiTYPER法评估了163个HCC样本及其配对正常组织中DNAH17的甲基化水平，并利用TaqMan拷贝数试剂盒分析来评估DNAH17在样本中的拷贝数状态。同时结合免疫组化、qPCR等验证该基因该肝癌中的表达差异。对ADRA1A的研究中，同样使用了SequenomEpiTYPER对分析了160个HCC患者中该基因的甲基化水平。通过构建稳转细胞系、免疫组化、转录组测序等方法，探索该基因在肝脏中潜在作用机制。
实验结果：
1、HCC组织和PVTTs的整体平均甲基化水平明显低于ANT(P＜0.01)。在HCC组织和配对的PVTTs之间共鉴定532个差异基因中864个差异甲基化CpG位点(平均甲基化差异＞10%，P＜0.005)。基于PVTT组织中高甲基化基因的KEGG通路分析显著富集于肌动蛋白细胞骨架调控通路(P=4.48E-5)。23个基因的甲基化水平在HCC和PVTT中呈梯度变化，其中17个基因的甲基化水平梯度升高(例如，PAK1、NDRG2、SLC9A3R2、ZC3H3)和6个基因梯度降低(ADORA2A、KIAA1143、NAPEPLD、PARVG、TNFRSF10A、TSTD1)。TNFRSF10A是TRAIL的关键细胞表面受体之一，可被rh-TRAIL激活。MTS实验和细胞凋亡实验表明，DAC和rh-TRAIL联合使用可协同抑制SK-Hep-1和Huh7细胞系的增殖以及诱导凋亡。
2、与ANT相比，肝癌组织的DNAH17平均甲基化水平显著降低(扩增子1:58.7%vs.84.5%(癌vs.癌旁)，P＜0.0001;扩增子2:69.9%vs.84.5%(癌vs.癌旁)，P=0.0060)。RNA-seq和免疫组化均显示肿瘤组织中DNAH17表达增加(P＜0.05)。DNMT抑制剂处理肝癌细胞可发现DNAH17表达上调。DNAH17基因扩增常和低甲基化状态并存。还发现低甲基化状态与男性患者、较高的AFP值、高龄、存在完整包膜、存在肿瘤坏死、肝硬化、肝癌癌栓等临床特征相关(P＜0.05)。ROC曲线分析显示，DNAH17的甲基化水平可以有效预测肝癌包膜(AUC=0.695)和肝癌癌栓(AUC=0.806)的存在。
3、ADRA1AmRNA水平和蛋白水平在肝癌组织中的表达水平明显降低。与ANT相比，160例肝癌患者的肿瘤组织中ADRA1A启动子区域的平均甲基化水平显著升高(25.2%：17.0%，P＜0.0001)。地西他滨作用肝癌细胞系，可以增加肝癌细胞系中ADRA1A的表达。此外，肝癌样本中ADRA1A基因的高甲基化水平与酒精摄入(P=0.0097)和甲胎蛋白(P=0.0411)存在明显相关性。ROC曲线分析显示，ADRA1A的平均甲基化水平可以区分HCC组织与癌旁非癌组织(AUC=0.700,P＜0.0001)。通过构建ADRA1A稳定敲减的肝癌细胞系的转录组测序结果显示，主要富集途径为癌通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和代谢通路(P＜0.01)。
结论：
我们的研究表明，DNA甲基化通过调节转移相关的途径在PVTT的形成中发挥重要作用。DAC与rh-TRAIL联合应用可能是一种有前景的HCC治疗策略。DNAH17的异常甲基化与肝癌的多种临床病理特点有关，可能是肝癌患者肿瘤血栓形成的一个有潜在应用价值的生物标志物。ADRA1A基因异常高甲基化可能参与HCC的发生，同样有可能作为HCC诊断的生物标志物。