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研究背景和目的目前,临床上进行乳腺癌前哨淋巴结活检的常用方法主要有三种,分别是染料示踪法、核素示踪法及染料与核素联合示踪法。染料法国外常用染料为专利蓝(patent-blue)、活力蓝(vital dye)及Isosulfan,而国内常用染料为1%亚甲蓝。其优点是直观,操作简单,不需要特殊设备,价格低廉,缺点是具有一定的盲目性,成功率易受操作者的经验和技术影响。核素示踪剂主要是由硫胶体或大分子右旋糖酐标记的99m锝(99mTc),术前即能探测到“热点”,能够更完全的发现前哨淋巴结,定位准确,但设备昂贵,并且存在辐射的污染。对于有经验的外科医师,两种方法的前哨淋巴结检出率和准确率无统计学差异。然而,联合应用能更准确地示踪前哨淋巴结,提高检出率和准确率,降低假阴性率。近年来新兴的荧光示踪法与染料法相比,具有更高的检出率,且不存在核素的放射性伤害。其原理是荧光示踪剂注射于乳腺原发肿瘤或其周围后,被淋巴系统内皮细胞吞噬或经内皮间隙进入淋巴系统,并停留在SLN中。通过激发光的照射,荧光示踪剂产生荧光,经滤光片和成像仪收集后,成像于屏幕,实现SLN的示踪。吲哚菁绿(Indocyanine Green, ICG)便是荧光示剂的代表。其又称靛菁绿,是一种具有近红外特征吸收峰的三碳吲哚染料,最大发射波长在795-845 nm之间,并且是两亲性结构,故具有既亲水又亲油的特性。然而,ICG ICG粒径太小,导致其在淋巴结中停留时间短,易通过SLN而进入第二站淋巴结,造成SLN假阴性。纳米活性炭(activated carbonnanoparticles, ACNP)是一种具有高度的淋巴系统趋向性,且能在淋巴系统中较长时间停留的材料,已作为一种新型的示踪剂应用于SLNB,操作简单而安全。但ACNP在灵敏性方面并没有明显优势。另外,由于其具有多孔蜂窝样结构,能较好地吸附药物,已有报道将其作为药物载体用于淋巴靶向化疗。本研究通过将ICG与ACNP结合形成ICG-ACNP复合体,并在小鼠上进行试验,探索ACNP是否能提高ICG的示踪效果。研究方法1. ICG-ACNP混悬液的制备将ACNP粉末混合PVP-K30,加入生理盐水,超声分散得到ACNP混悬液。用透视电镜观察ACNP的物理表征,并在常温下观察其混悬液的稳定性。将ACNP吸附ICG制得ICG-ACNP混悬液。用分光光度计测得ICG在最大吸收波长780nm处的吸光度,通过标准曲线得到ICG对应的浓度,进而求得ACNP对ICG的吸附率,得到最优化的ACNP与ICG质量比及吸附时间。用Zetasizer3000HS纳米粒度及电位分析仪测量成功制备的ICG-ACNP的水化粒径和Zeta电位。2.ICG的浓度选择将20只BALB/c小鼠随机分为4组,每组5只,于左后肢足垫皮内注射不同浓度的ICG溶液,15分钟后在活体成像仪中观察各组胭窝淋巴结显影情况。3.ICG与ICG-ACNP在小鼠上示踪效果比较将10只BALB/c小鼠随机分为2组,每组5只,分别于左后肢足垫皮内ICG溶液或ICG-ACNP混悬液。用活体成像仪观察注射后5、15、30、60、120分钟淋巴结的显影情况。结果1. ACNP的物理表征及稳定性透射电子显微镜下可以看到,ACNP是形态近似球形的颗粒,表面光滑,杂质较少,粒径约40nm,可见数个ACNP聚集成团。制备的ACNP混悬液呈黑色,分散均匀,肉眼未见粒团、挂壁或沉淀。对该混悬液离心后,再进行超声分散,可以恢复原来性状。2. ICG-ACNP混悬液的制备在ICG浓度为250mg/L时吸附率达到最高,10mg的ACNP吸附了溶液中93%的ICG。因此ICG与ACNP的最佳质量比为1：4。ACNP在超声分散30min后已吸附了52%的ICG,90min后吸附的速率显著减慢,在120min达到吸附平衡。3.ICG浓度选择ICG浓度为20、40、80ug/ml时产生的荧光强度无明显差别(P>0.05),但均明显强于浓度10ug/ml (P<0.05).选择20ug/ml为研究使用的浓度。4.ICG与ICG-ACNP在小鼠上示踪效果比较注射后5分钟两组小鼠胭窝淋巴结均显影清晰,但ICG-ACNP组荧光强度弱于ICG组(P<0.05)。注射后30、60、120min ICG-ACNP组荧光均强于ICG组(P<0.05)。注射后60min,ICG组中1只小鼠髂内侧淋巴结出现荧光,注射后120min,ICG组共有3只小鼠出现髂内侧淋巴结荧光。实验过程中,ICG-ACNP组始终未见髂骨旁淋巴结荧光。结论1.成功制得了较为稳定的纳米炭混悬液分散体系,并通过探索不同ICG浓度及不同吸附时间对ACNP吸附效果的影响,确定了ICG-ACNP的最优制备条件,为今后的进一步研究奠定了基础。2.本研究通过将ICG与ACNP结合,提高了ICG的淋巴靶向性,使其能够更长时间地聚集在SLN中,不容易通过SLN进入第二站引流淋巴结。实验中并未发现ACNP对ICG的荧光特性造成影响。其临床的可行性尚需要进一步的深入研究。同时,本研究也证实了ACNP具有较强的淋巴靶向性,是携带药物进入淋巴系统的理想载体。