施氏假单胞菌JP1厌氣降解多环芳烃机制的研究

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多环芳烃(PAHs)是持久性有机污染物(POPs)中的一种,对生物体具有致癌、致突变、致畸等严重危害。人类活动和能源利用过程中产生的多环芳烃通过污水排放、地面径流、大气沉降等途径进入海洋,最终的归宿是海底沉积物,海底环境缺氧又极大的限制了其降解。课题组前期从汕头海域海底表层沉积物分离得到的兼性厌氧菌施氏假单胞菌 JP1(Pseudomonas stutzeri JP1),能够在有氧和厌氧条件下降解多种多环芳烃。本文以菌株 JP1为研究对象,研究添加碳源、氮源、电子受体以及不同盐度和时间对菌株厌氧降解苯并(a)芘的影响,通过GC-MS检测菌株降解PAHs的产物,通过基因组测序、转录学验证功能,分析其厌氧降解苯并(a)芘的差异蛋白,探索菌株 JP1厌氧降解苯并(a)芘等高分子量多环芳烃的机制,为阐明其微生物厌氧降解机制奠定了坚实的基础。  研究结果表明:菌株 JP1能够在厌氧环境中降解苯并(a)芘等多环芳烃。随着时间的增加菌株对苯并(a)芘的厌氧降解率逐渐增加;在盐度20‰时厌氧降解率最高;二糖能促进菌株对苯并(a)芘的厌氧降解,而单糖则抑制降解;除了L-天冬酰胺之外,其他几种氨基酸都能促进菌株厌氧降解苯并(a)芘;菌株 JP1对菲的厌氧降解率高于对蒽的降解率,对芘、?、苯并蒽的厌氧降解率则无明显差异;添加亚硫酸钠、氧化铁、氯酸钾对菌株 JP1厌氧降解苯并(a)芘有明显促进作用,硫代硫酸钠、高氯酸钾、碳酸氢钠对菌株 JP1厌氧降解苯并(a)芘反而有抑制作用。  菌株 Pseudomonas stutzeri JP1在厌氧环境中能够将苯并(a)芘降解为1,2-二甲基苯并蒽、7,8,9,10-四氢苯并(a)芘、5-乙基?三者中的一种或多种,?或/和苯并蒽,另外还产生大量的支链烃类。菌株 JP1厌氧降解芘生成4,5-二甲基菲,4-甲基菲,菲。菌株JP1厌氧代谢苯并蒽的产物有2,3-二甲基菲,2-甲基菲,以及2-甲基蒽/1-甲基蒽中的一种或两种。菌株 JP1厌氧降解?的产物有α-甲基二苯乙烯,1-乙基-2-甲基菲,2-甲基菲,1-甲基菲。菌株 JP1厌氧降解菲生成1,2,3,4-四氢化-4-甲基-4-菲酚或/和α-甲基二苯乙烯。菌株 JP1厌氧代谢蒽生成9,10-蒽醌或/和1-蒽醌羧酸。菌株JP1在有氧环境中能够将苯并(a)芘降解为1,2-二甲基苯并蒽、7,8,9,10-四氢苯并(a)芘、5-乙基?三者中的一种或多种,以及1,6-二乙基-4异丙基萘,另外也产生大量的支链烃类。  全基因组测序结果表明:菌株 JP1基因组全长3.59 Mb,含有4533个基因。其中的一些基因组成了几个基因簇,包括:一个有氧降解芳烃的基因簇,两个厌氧降解芳烃的基因簇,三个硝酸盐还原相关基因的基因簇,并对基因簇中的一些代表性基因通过实时荧光定量 PCR进行了转录表达功能验证,其中一些基因参与厌氧降解苯并(a)芘。在菌株JP1中已发现有43个芳烃厌氧降解中心途径苯甲酰CoA连接酶途径的基因,另外还有一些降解其他芳烃途径的基因。  菌株 JP1不含质粒,因此推测其全部基因位于染色体中。对菌株厌氧降解苯并(a)芘的差异蛋白质谱分析,得到一个参与外来污染物生物降解和代谢以及糖酵解/糖异生的醇脱氢酶(6-羟基环己-1-烯-1-羰基酰-CoA脱氢酶),对其进行实时荧光定量PCR分析进一步证实了其参与多环芳烃的厌氧代谢。  对菌株JP1在四种培养条件(LB培养基中有氧培养(ae_LB),LB培养基中厌氧培养(an_LB),含苯并(a)芘的无机盐培养基中有氧培养(ae_BaP),含苯并(a)芘的无机盐培养基中厌氧培养(an_BaP))下进行转录组分析。ae_BaP中,外显子和基因间隔区域分别占37.3%和62.7%;ae_LB中,外显子和基因间隔区域分别占65.7%和34.3%;an_BaP中,外显子和基因间隔区域分别占32.4%和67.6%;an_LB中,外显子和基因间隔区域分别占60.0%和40.0%。分别对ae_BaP vs ae_LB;an_BaP vs ae_BaP;an_BaP vs an_LB;an_LB vs ae_LB的差异表达基因进行分析以及GO富集分析和KEGG富集分析,并进行SNP、InDel、基因结构、UTR、sRNA分析,以及新转录本和反义转录本预测。转录组学信息进步一步完善和补充了对菌株JP1中的基因参与厌氧降解苯并(a)芘的认识。
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