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水稻是重要的粮食作物之一。叶片是进行光合作用的主要器官,对植物的生长发育具有重要的作用。叶片形态的改变直接影响水稻光合速率,蒸腾速率和水稻产量。目前,有关窄叶基因的报道并不多,克隆出相关的基因则是更少,挖掘出更多与叶片宽度有关的基因将会为进一步研究水稻叶片宽度发育的分子机理打下坚实的基础。本研究对两个水稻叶型突变体进行了形态及细胞学观察、基因图位克隆以及功能分析,分为以下两个部分:1、利用EMS诱变粳稻品种圣稻808,得到稳定隐性遗传窄叶突变体sd110。对突变体sd110的研究结果如下:(1)突变体sd110主要性状表现为叶片宽度减少了50%(剑叶表型较轻,倒二、倒三叶更为严重)、叶长变短,植株半矮,茎节数目减少、长度变短,分蘖增多。(2)通过对sd110叶片横向徒手切片,发现突变体叶片大脉、小脉数量减少。在显微镜下观察和统计叶片下表皮细胞,发现细胞大小变化不明显,而细胞数目显著减少。(3)遗传分析表明,该叶形突变体受1对隐性基因控制。运用图位克隆技术将突变位点锁定在第3号染色体59 kb区域内。对该区间内所有基因进行测序后,发现LOC_Os03g10340(编码核糖体蛋白小亚基)第二内含子5’端拼接点处由GT突变为AT。cDNA测序结果显示,突变体中该基因发生了两种错误的拼接方式。第一种:第二内含子未被剪切掉;第二种:在原有的内含子5’端拼接处前8个碱基又识别了一个新的拼接点。将该基因的野生型基因组DNA片段转入到sd110突变体中可以回补突变表型;将该基因的RNAi干扰载体转入到野生型中能够产生与sd110突变体相似的表型,从而证实了该基因就是控制叶片宽度的目的基因。.(4)实时定量PCR和GUS组织化学染色结果显示该基因在叶片、种子、茎节、幼穗中的表达量比较高。(5)构建该基因编码序列与绿色荧光蛋白基因GFP的瞬时表达载体并转化水稻原生质体,发现该蛋白定位于内质网上。2、利用60Co-γ射线诱变粳稻品种春江06,得到稳定隐性遗传窄叶突变体F2-195。对突变体F2-195的研究结果如下:(1)突变体F2-195主要性状表现为叶片变细、颖壳开裂以及分蘖增多,但植株高度和叶片长度变化较小。在体视显微镜下观察突变体F2-195叶片横截面,发现与野生型相比,突变体叶片大脉、小叶脉数量分别减少了50%。通过刮除F2-195叶片上表皮,统计叶片下表皮的细胞大小和数量,发现叶片宽度的变化主要是由于细胞数目减少50%,而细胞宽度没有明显变化。石蜡切片结果显示突变体F2-195叶片边缘发育不正常。(2)利用图位克隆的方法,将突变体F2-195的突变位点定位于第11和12号染色体短臂上12.7 kb区域内,目标区间内只有一个基因即WOX3。经水稻基因组网站分析得知,水稻第11和12染色体短臂(0-3 Mb)发生了大片段复制。测序结果表明,第11染色体上的WOX3(LOC_Os11g01130,命名为NAL2)在野生型和突变体F2-195中均发生了自然突变,在+477 bp处插入了一个长度为5211 bp反转座子;而第12染色体上的WOX3(LOC_Os12g01120,命名为NAL3)在突变体F2-195中发生了大片段缺失,从而导致NAL2/3功能缺失,最终产生细叶表型。(3)将WOX3启动子序列(2500 bp)与报告基因GUS融合,并转化水稻品种Shiokari。GUS染色结果表明,该基因在幼叶、叶鞘、茎节、叶枕、幼穗等分裂旺盛的组织中表达量比较高。(4)WOX3属于Wuschel related homeobox转录因子家族。为了证实WOX3是否具有转录激活或抑制活性,将WOX3编码序列及WUS Box点突变后的WOX3(WOX3M)编码序列分别与酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域融合,用来驱动上游含GAL4结合序列的荧光素酶基因在水稻原生质体中表达。通过检测荧光素酶活性,发现WOX3具有明显的转录抑制活性。为了进一步证实该结论,分别构建WOX3M与转录因子激活基序VP64和抑制基序EAR融合表达载体并转化F2-195突变体,发现WOX3M-EAR转基因后代叶型变宽,而WOX3M-VP64叶型变窄,最终证实WOX3具有转录抑制作用。(5)动态分析野生型和突变体第一片叶片细胞分裂情况,连续统计11天,发现突变体细胞分裂速率明显慢于野生型,从而推测突变体窄叶表型是由于细胞分裂速率降低造成的。流式细胞术分析结果表明,突变体S期和G2/M期细胞数目减少,G1期数目增加。定量PCR分析结果发现,突变体中一些抑制细胞分裂G1/S期转换的关键基因如KRP1、KRP3、KRP4和RB1的表达量上调。(6)构建了F2-195(nal2/3)与另一已知窄叶突变体nal1的三突变体,发现三突变体整体形态和叶片表型均偏向于nal1,证明在叶型调控网络中nal2/3可能位于nal1的上游。(7)构建了F2-195(nal2/3)与已得到的窄叶突变体sd110的三突变体,发现三突变体整体形态和叶片表型均偏向于nal2/3,证明在叶型调控网络中nal2/3可能位于sd110的下游。