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本文研究了几种培养条件对溶藻弧菌胞外产物(ECP)产量的影响、ECP的理化和生物学特性及其致病机理。
结果表明,培养条件对溶藻弧菌ECP的产量有重要影响,用胰胨豆胨琼脂培养基(TSA+2%NaCl)培养48h ECP蛋白产量达到最高,酶活性较强。溶藻弧菌用TSA培养基培养48 h,用PBS洗下培养物,离心后上清用0.22 μm的微孔虑膜过滤,制备了溶藻弧菌ECP粗提液。经检测,该ECP具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等多种酶活性,对青鲈、美国红鱼和赤点石斑鱼等海水鱼类的红细胞有一定的溶解能力,溶血价分别为25、23和21。ECP对小白鼠和石斑鱼的LD50分别为0.08 mg/g和0.17 mg/g。将偶氮酪蛋白掺入丙烯酰胺聚合后,加ECP作SDS-PAGE,37℃原位消化,染色,有四条比较明显的透明蛋白带,显示出ECP中存在四种不同分子量大小的蛋白酶;此外,用脱脂奶琼脂平板法和偶氮酪蛋白(Azocasein)底物法也均能检测到胞外产物中蛋白酶的存在。经Laemmli不连续SDS-PAGE凝胶电泳,该ECP至少有10种蛋白成分,有四条清晰蛋白带,分子量在29KD~66KD之间,其中一条带的分子量约为33KD。ECP与乙二胺四乙酸(EDTA)或者丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)作用,其胞外蛋白酶(ECPase)的活力有不同程度的下降,分别为83.40%和51.32%。该酶对热不稳定,在pH 6.0到10.6之间显示出较高酶活性,它的最适pH为8.0,最适温度为50℃,37℃下最适作用时间为70 min。粗提ECP经硫酸铵盐析,DEAE-纤维素层析和Sephadex G-100分子筛层析分离纯化了几种胞外蛋白,酶活性存在于第一洗脱峰。
用ECP注射石斑鱼后,分析了红细胞(RBC)的数量、白细胞(WBC)的数量、红细胞及其核的大小、血红蛋白(Hb)含量、渗透脆性、白细胞(WBC)的分类和比率、血清无机离子浓度以及几种酶的含量等。血液病理学测定结果表明:在红细胞中,注射组和对照组的红细胞数分别为1.60百万/mm3和3.30百万/mm3,血红蛋白值分别为5.17g/100mL和7.46g/100mL,红细胞渗透脆性分别为0.54﹪和0.32﹪;在白细胞中,注射组和对照组的白细胞数分别为34.00万/mm3 和20.38万/mm3,嗜中性粒细胞比率分别为29.40﹪和61.60﹪,淋巴细胞比率分别为70.20﹪和37.90﹪,单核细胞比率分别为1.40﹪和0.90﹪。注射ECP后的石斑鱼与对照组石斑鱼相比,红细胞血红蛋白值(Hb)降低,红细胞数量减少,白细胞数量增加,红细胞渗透脆性增加,白细胞中嗜中性粒细胞比率降低,淋巴细胞比率明显升高,表明注射组石斑鱼有贫血倾向和其它相应的病理变化,并且发现血涂片中注射组鱼的红细胞容易破裂,对照组鱼的血涂片上可以看见成群出现的血小板,而在注射组鱼的血涂片上几乎见不到此种现象,血小板数量明显减少且不成群出现。在血清生化指标中,注射组和对照组的K+浓度分别为274.04μg/mL和262.77μg/mL,Na+浓度分别为2832.78μg/mL和3264.00μg/mL,Ca2+浓度分别为136.59μg/mL和142.42μg/mL,Mg2+浓度分别为41.46μg/mL和34.84μg/mL,尿素氮浓度分别为1.75mmol/L和1.31mmol/L,葡萄糖浓度分别为0.58mmol/L和0.98mmol/L,总蛋白含量分别为44.00g/L和48.60g/L,谷丙转氨酶分别为463.40IU/L和88.80IU/L,谷草转氨酶分别为209.00IU/L和80.00IU/L,乳酸脱氢酶分别为1144.20IU/L和372.80IU/L,磷酸肌酸激酶分别为10421.80IU/L和1854.00IU/L。对所得结果用t检验法进行统计学分析,结果表明注射组和对照组石斑鱼在这些指标上多存在显著差异,可认为溶藻弧菌ECP在溶藻弧菌对石斑鱼的致病中发挥了重要作用。
注射ECP的石斑鱼48h后开始出现死亡,注射后表现出一系列临床症状:平衡能力低,运动迟缓,体色变深,注射部位出现红肿,结痂,腹部膨大,打开腹腔可见明显的积水,肝脏出血有花斑,肾脏和脾脏肿大,肠道内无食物。取刚刚死亡或者濒临死亡石斑鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠、鳃、心肌等组织制备病理组织切片,显微观察发现这些组织均发生较病变,其中尤以肾脏和脾脏病变最为明显。部分肝细胞坏死,解体,肝脏出血,肝索中有红细胞浸润,肝组织中巨噬细胞增多;脾脏中细胞结构不明显,细胞坏死,小动脉扩张;肾小管上皮细胞脱落、坏死,严重者甚至整个上皮细胞层脱落下来;肠内没有食物,肠粘膜上皮细胞脱落、坏死,微绒毛模糊不清;另外,还从肝脏、脾脏、肾脏、肠、心肌、鳃等病理组织发现一种类似小动脉扩张的相同结构,而在正常的组织切片中均没有此种结构。