论文部分内容阅读
目的原发性肝细胞癌（Primary Hepatocellular carcinoma,PHC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,主要危险因素包括肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）和/或丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）的慢性持续性感染、滥用酒精、黄曲霉毒素、化学毒物及非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）等。近年,NAFLD发病率速度上升,与PHC关系密切,其发病机制有待阐明。本文通过建立脂肪肝和肝癌动态发生模型,在肝脂肪积累状态下,以二乙酰氨基芴（2-FAA）诱发肝细胞恶性转化,在此过程中以基因表达谱芯片技术筛选肝癌差异表达基因,进一步生物信息学分析,重点观察肝细胞癌变过程中分子标志物改变、免疫相关潜在靶点及线粒体内膜酶学变化,以探讨脂代谢异常与肝细胞恶性转化的关系。方法雄性SD大鼠94只分为正常对照、脂肪肝和诱癌组,分别以常规颗粒,高脂颗粒及含2-fluorenyl acetamide（2-FAA,0.05%）高脂颗粒饲料喂饲共14周。每两周处死对照鼠1只、脂肪肝和诱癌鼠各一组,留肝组织和血液。肝组织按H&E检查分为对照组、脂肪肝组、变性组、癌前病变组和癌变组。肝脂质以油红O染色,定量血总胆固醇（Tch）、甘油三酯（TG）、转氨酶（AST,ALT）水平,分别从各组肝组织中抽提RNA并合成cRNA,利用基因表达谱芯片对cRNA进行标记、杂交、扫描,得到对照组、脂肪肝组、肝变性组、癌前病变组和肝癌组两两比较的差异表达基因数据,筛查差异表达基因进行基因GO功能分析、KEGG pathway功能分析和STRING蛋白互相作用关系分析,找到与肝细胞癌恶性转化过程中的肿瘤标志、以免疫组织化学及定量检测线粒体内膜肉毒碱棕榈酰转移酶-II（Carnitine palmitoyl transferase-II,CPT-II）等相关基因的改变。结果1、成功制备脂肪肝和肝细胞恶性转化模型:摄入脂肪后SD鼠肝细胞见大量脂肪积聚,对照鼠脂肪含量明显低于脂肪肝组（t=-11.556,P<0.001）、变性组（t=-4.847,P=0.04）、癌前病变组（t=-13.652,P=0.005）和癌变组（t=-10.896,P=0.008）。变性组、癌前病变组和癌变组血清TG,Tch水平明显高于对照组（P<0.05）,TG和Tch升高23倍。经2-FAA诱癌后肝细胞形态学表现为肝细胞发生变性、癌前病变和癌变的发展过程,伴有肝细胞损伤,AST及ALT活性显著高于正常对照组（P<0.05）的48倍。2、全基因表达谱变化:应用基因表达谱芯片,两两比较筛选出10组差异表达基因,其中脂肪肝vs对照组差异表达基因有163个,肝变性组vs对照组差异表达基因有934个;癌前病变组vs对照组差异表达基因有1452个,癌变组vs对照组差异表达基因有1738个。3、相关信号通路改变:在肝细胞恶化过程中发现差异表达基因所在通路多条,主要有固醇合成通路、P53信号通路、细胞周期信号通路,同时发现固醇合成通路中的Cyp51,Tm7sf2在肝细胞恶性转化过程中显著下调,Ccnb1和CDK1既与P53通路又与细胞周期相关,且在蛋白相互作用网络中皆处关键位置。4、线粒体内膜CPT-II变化:测定肝组织CPT-Ⅱ比浓度（CPT-II ng/mg肝蛋白,ng/mg P）显示:对照组明显高于脂肪肝组（t=2.641,P=0.035）、变性组（t=7.559,P<0.001）、癌前病变组（t=5.504,P<0.001）和癌变组（t=6.825,P<0.001）;脂肪肝组CPT-II比浓度明显高于变性组（t=10.210,P<0.001）、癌前组（t=4.721,P=0.001）和癌变组（t=7.100,P<0.001）,肝组织CPT-II含量逐渐减少;肝CPT-II免疫组化半定量显示:对照组平均吸光度值为（59.92±14.26）×10-3,明显高于脂肪肝组（40.06±11.58）×10-3;t=2.648,P=0.025)、变性组（6.74±1.66）×10-3;t=9.071,P<0.001)、癌前病变组（9.94±3.02）×10-3;t=8.397,P<0.001)和癌变组（7.44±2.85）×10-3;t=8.836,P<0.001),且脂肪肝组平均吸光度值明显高于变性组（t=6.976,P<0.001）、癌前组（t=6.166,P<0.001）和癌变组（t=6.698,P<0.001）,肝CPT-II含量随肝细胞恶性转化而呈下调表达。5、肝细胞恶性转化相关标志变化:在转录水平,肝GPC3、CD44 mRNA表达在对照组明显低于变性、癌前病变和癌变组;AFP m RNA表达在对照组明显低于癌前病变（t=-4.051,P=0.003）和癌变组（t=-2.836,P=0.021）;在蛋白水平,血清AFP和GPC3浓度（ng/mL）及肝湿重组织比浓度（ng/mg W.T.）,对照组均明显低于变性、癌前和癌变组;血清CD44对照组明显低于变性（t=-3.562,P=0.015）、癌前（t=-9.347,P<0.001）和癌变组（t=-7.131,P=0.001）;肝CD44比浓度对照组明显低于癌前（t=-6.82,P<0.001）和癌变组（t=-6.836,P<0.001）,在脂肪肝恶性转化过程中,肝及血AFP、CD44和GPC3等表达增加与基因水平相一致。结论以肝脂肪积聚和肝癌动态发生双模型,成功观察肝细胞在脂肪积聚状态下发生恶性转化,在此过程中众多基因参与,富集于固醇合成、P53、细胞周期相关通路等;肝细胞恶性转化相关标志等异常表达,提示脂质积累致肝细胞恶性转化的分子机制极其复杂,值得深入研究。