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乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的严重威胁人类健康的传染性疾病，目前全球范围内大约有超过3.5亿人受到HBV危害。大约有15～40％的HBV感染者最终会发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝硬化和肝衰竭。我国是乙型肝炎主要的流行区，现患慢性乙型肝炎的病人已突破1000万。迄今为止，慢性乙型肝炎的治疗仍无良策，因此，研制新型HBV疫苗和寻求有效的治疗乙型肝炎的手段迫在眉睫。2型重组腺相关病毒(adeno-associated vires type 2，rAAV-2)作为一种大有希望的基因转移载体，因能有效转导多种组织和细胞而引起了人们的高度重视。为此，本研究以研制新型HBV疫苗为目的，构建了表达HBV外膜主蛋白、大蛋白基因的rAAV-2，初步研究了其免疫原性，并探讨了表达HBV抗原基因的rAAV-2用于以树突状细胞(dendritic cell，DC)为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。 采用PCR法从PTHBV—1质粒中扩增HBV(ayw亚型)外膜主蛋白(HBsAg)、大蛋白(LHBsAg)基因；将PCR扩增产物插入rAAV-2表达质粒pSNAV中，构建重组质粒pSNAV-HBsAg和pSNAV-LHBsAg；用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK—21细胞中，G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因细胞系BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg；用具有rAAV包装功能的重组单纯疱疹病毒(HSV1-rc/ΔUL2)感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg，纯化后得到rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg；用高效液相色谱仪(HPLC)检测和SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测了rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg的纯度；以点杂交方法检测重组病毒的物理滴度；ELISA检测混合细胞系博士论文:，、HB、，卜膜主蛋。、、蛋。、重组腺，关病毒的构减巍免。性研究BHK一HBsAg和BHK~LHBsAg中表面抗原(HBsAg)的表达，rAA认HBsAg和rA戌认LHBsAg在BHK一21细胞和293细胞中的表达。结果表明，H卫LC分析显示主峰为总面积大于99%;SDS一PAGE电泳结果显示3条特征性条带，其间的杂蛋白量非常少;点杂交检测rA戌瞬2一HBsAg和rAA认2.LHBsAg的物理滴度分别为sxlo，‘和ZxlolZ virusp耐cles/nil(vp翔吐);混合细胞株BHK一HBsAg中HBsAg的表达量为28.6士6.7ng乃x ro6eells，BHK~LHBsAg中HBsAg的表达量为15.4士5.5 ng zsxl06eeus;rA戌认2~HBs^g和rAAv-2~LHBsAg感染BHK一21细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达，表达量随感染复数(伽ltiplicityofinfection，MOI)的增加而升高。提示我们已经获得了高滴度、高纯度、在体外能有效地感染培养细胞的rAAV-2一HBsAg和rAAv-2.LHBSAg，为下一步工作奠定了基础。 本文首次报道了rA戌认2载体介导HBV抗原基因用于HBV疫苗的研究。通过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲给药途径，我们观察了rA入v-2~HBsAg和rAA认2.LHBsAg在小鼠体内的转导效率和诱导小鼠产生HBv抗原特异性的体液和细胞免疫反应的能力。结果显示，rAAv-2~HBsAg和rAAv-2.LHBsAg通过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲途径进入小鼠体内后能有效表达HBsAg，同一给药途径，rA戌瞬2.HBsAg和rA入叭2~LHBsAg在小鼠体内HBsAg的表达水平无明显差异(p>0 .05);同一重组病毒(rA戌认2一HBsAg或rAAV一2一LHBsAg)不同给药途径之间HBsAg的表达水平亦无明显差异(p>0 .05)。重组病毒通过不同途径在小鼠体内表达的同时，可在较长时间(80天)诱导小鼠产生HBV抗原特异性的体液和细胞免疫反应:不同给药途径之间的免疫效果比较发现，肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲都能诱发机体产生HBV保护性抗体和激发CTL产生，但以尾静脉注射效果最好，腹腔注射、肌肉注射和胃饲三者之间差别不大 (p>0 .05);在各种给药途径中，免疫反应能否出现、以及免疫反应的强度与剂量(给予的重组病毒颗粒数)有关。结果提示，基于rAAV载体的HBV疫苗，对于防止HBV感染，尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗和应用于对现有HBV疫苗无反应的患者无疑具有潜在的应用价值，值得做进一步的系统研究。 近年来，以DC为基础的免疫治疗已成为抗肿瘤和抗感染等研究的热点，本文也探讨了表达HBV抗原基因的rAA认2载体用于DC为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。首先，我们用表达报告基因一绿色荧光蛋白(GFP)基因和荧光素酶(luciferase，Luc)的rA月认2(分别简称为rAA认GFP和rAAV-Luc)感染了人外周血单核细胞来源DC以观测感染效能，在激光共聚焦显微镜观察了F仃C博士论文:表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究(fluorescein 150而Ocyanate，FITC，异硫氰酸荧光素)标记的rAA认2进入Dc的动态过程;结果显示，激光共聚焦显微镜下观察到了rAAV-2能进入DC;只有当Mol(multiplicity of infeetion，感染复数)大于1 X losvp/c ell时，乙AAV-2一lue和rA戌认2一GFP才能有效感染DC，需较高的MOI值的重组病毒才能有效感染Dc，报告基因的表达水平在MOI值为1 X 105一5 x 106vPlcell之间呈剂量依赖趋势，此后再提高MOI值并不能明显提高表达水平，感染后的DC表达水平不高。表明rAA认2可以有效感染DC，但转导效率?