1研究背景及目的一直以来,乳腺癌作为全球女性中发病率和致死率最高的癌症而受到医药学专家的高度关注,其中,乳腺癌的转移是其致复发和致死的最主要原因。本课题的研究对象狼毒宁B(Chamaejasmnin B, ICJ)是从瑞香科狼毒属的植物瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)中提取的黄酮类化合物。本课题组的前期研究结果显示,ICJ可以通过调节肿瘤细胞的运动、侵袭能力,抑制乳腺癌的上皮-间质转分化进程,进而抑制乳腺癌的肿瘤转移。同时,ICJ还能够从微环境的角度,在低剂量状态下,对肿瘤微环境中的巨噬细胞功能和TGF-β平衡具有明确的调节活性。然而,肿瘤的新生血管作为肿瘤转移的最主要途径和第一站,在肿瘤转移中起到了至关重要的作用,而狼毒宁B是否能够调控肿瘤的血管生成过程,此研究领域尚属空白。本课题将根据前期工作提示,以乳腺癌微环境为基础,在体内、外水平探索ICJ抗乳腺癌肿瘤血管生成的药效作用,并以乳腺癌微环境中的血管内皮细胞的功能性改变为切入点,进行机制的发掘和研究,探索“ICJ-乳腺癌细胞-血管内皮细胞”的相互作用关系以及ICJ在乳腺癌微环境的重塑中发挥的作用。2研究方法2.1 ICJ体外抑制乳腺癌血管生成的药效学研究采用人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)建立共培养模型和肿瘤条件培养基过继转移模型,模拟乳腺癌微环境进行实验。首先,采用MTT法检测了ICJ对MDA-MB-231以及肿瘤条件培养基对HUVEC的增殖影响,以不明显影响细胞的生存为前提,确定了体外ICJ的作用浓度和时间(0.5、2、8μg/mL,24 h)。在这两个模型下,通过划痕修复实验(Wound healing)检测HUVEC增殖、运动能力变化；Transwell实验检测HUVEC的迁移、趋化能力变化；通过毛细血管网形成实验(Capillary-like tube formation)观察HUVEC细胞出芽、移行、成管的能力。在此基础上,进行大鼠胸主动脉环的体外3D培养,在离体组织水平观察血管生成的情况。2.2 ICJ体内抑制乳腺癌血管生成的药效学研究在体外药效得到验证的基础上,在体内水平,首先使用4T1细胞注射于BalB/c小鼠第四对乳房垫一侧,构建了小鼠乳腺癌原位移植瘤模型(Xenograft model),小鼠分为模型对照组、ICJ处理组(30、150、750 μg/kg),腹腔注射给药,1次/d,持续25d.通过对小鼠腹壁血管的形态学观察和肿癌血管标志分子CD146免疫组化检测,评价ICJ抑制原位乳腺癌血管生成情况。其次,使用4T1细胞腹部皮下埋植构建了C57BL/6小鼠基质胶体内埋植模型(Matrigel plug)。小鼠分为阴性对照组、模型对照组、ICJ处理组(30、150、750 μg/kg),腹腔注射给药,1次/d,持续7d。通过观察基质胶的颜色和重量、Drabkin’s法检测基质胶内的血红蛋白含量、免疫组化法检测基质胶内的CD146表达,在体内水平综合评价ICJ对乳腺癌血管生成的药效作用。2.3 ICJ抑制乳腺癌血管生成的机制研究首先,在光镜下观察了ICJ对HUVEC形态特征的影响；使用透射电镜观察了HUVEC细胞的超显微结构；使用间接免疫荧光法结合共聚焦显微镜观察,观察了HUVEC细胞中LC3的亚细胞定位；使用Western Blot对自噬标志性分子LC3I/Ⅱ、Beclin-1的表达进行了检测。同时,使用Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测、caspase-3活性的检测以及使用Western Blot检测Bik的表达,排除了ICJ对乳腺癌微环境中的HUVEC具有凋亡诱导作用。为研究自噬与血管生成之间是否具有相关性,分别使用Bafilomycin A1和Beclin-1 shRNA转染的方法从外源和内源两个方面阻断自噬,观察HUVEC成管能力变化。在自噬和血管生成之间具有因果关系的前提下,使用RT-PCR检测MDA-MB-231中VEGFA的mRNA水平,使用Western Blot法检测阻断自噬前后HUVEC中的VEGFR2表达水平,并通过免疫共沉淀法检测了LC3Ⅱ和VEGFR2的相互作用,较为系统地对ICJ通过诱导血管内皮细胞自噬抑制血管生成的机制进行了探索。最后,使用ELISA法对共培养体系中TNF-a的水平进行了检测,对在肿瘤细胞和血管内皮细胞中介导自噬诱导信号的分子进行了初步探索。3研究结果3.1 ICJ体外抑制乳腺癌血管生成的药效学研究在肿瘤细胞-血管内皮细胞共培养模型和肿瘤条件培养基过继转移模型中,①MTT结果显示,2-8μg/mL的ICJ对MDA-MB-231细胞作用24h,对细胞生存抑制率均在10%以下,2～8 μg/mL的ICJ处理后条件培养基(Post ICJ treated conditional medium)对HUVEC的抑制率均低于20%；而进一步提高ICJ浓度或延长作用时间即会对两株细胞产生较明显的生存抑制作用。综合考虑了剂量和时间因素,最终选择0.5、2、8 μg/mL的ICJ处理24h作为后续实验的处理条件；②划痕修复实验结果显示,在初始划痕宽度一致的前提下,ICJ处理组的HUVEC在24h之后,划痕宽度明显大于对照组(P<0.01),且具有剂量依赖性；③Transwell结果显示,与对照组相比,ICJ处理组的HUVEC穿膜细胞数明显减少(P<0.01),且具有剂量依赖性；④成管实验结果显示,与对照组相比,ICJ处理组的HUVEC细胞出芽率明显下降(0.5 μg/mL组,P<0.01; 2、8μm/mL组,P<0.001),形成完整、封闭的管腔数目减少；⑤大鼠主动脉环实验结果显示,与对照组相比,ICJ处理组主动脉环周围形成的毛细血管数目明显减少,断裂增多,并表现出明显的剂量依赖性(P<0.01)。3.2 ICJ体内抑制乳腺癌血管生成的药效学研究在乳腺癌原位移植瘤模型中,可以观察到：①在形态学水平,模型对照组小鼠的新生血管数量多,管径粗,突出腹壁,呈现树根状。低剂量ICJ给药组腹壁血管数减少,管径变细,随着剂量的增加,腹壁血管数目和分支数进一步减少,管径变细。其中,中剂量ICJ的抑制血管生成作用最明显。②在组织学水平,免疫组化结果显示,CD146在模型对照组的肿瘤组织中；,呈现强阳性表达,且组织中可见较多的血管样结构,而ICJ的干预可以明显减少肿瘤组织内部的血管结构,并且明显减弱CD146的表达。在基质胶皮下埋植模型中,可以观察到：①与阴性对照组相比,模型对照组埋植体颜色呈深红色,体积及重量大(P<0.01)；ICJ的处理可以使埋植体颜色明显变浅,并显著减小埋植体的体积和重量(与模型组相比,P<0.05和P<0.01),其中,ICJ 0.15 mg/kg剂量组的抑制作用最明显。②Drabkin’s检测结果显示,模型对照组的埋植体内血红蛋白含量较阴性对照组明显升高(P<0.01),而ICJ处理组的血红蛋白含量下降,且中剂量结果最明显,与模型组相比,由非常显著统计学差异(P<0.01)。③CD146的免疫组化结果显示,在阴性对照组中,无阳性信号；在模型组中CD146表达量明显增高,且有大量静脉、动脉和毛细血管结构的形成；在ICJ处理组,CD146表达量明显降低,肿瘤细胞数目和血管结构减少。3.3 ICJ抑制乳腺癌血管生成的机制研究①在光镜下,对照组中的HUVEC形态正常,排列致密,ICJ处理组的HUVEC细胞形状不规则,排列紊乱疏松。②在透射电镜下,对照组HUVEC细胞的超微结构正常,而ICJ处理组的HUEVC细胞中出现大量自噬小体,且呈剂量依赖性。③间接免疫荧光结果显示,对照组的HUVEC中,LC3呈弥散状均匀分布,表达强度较弱；而ICJ处理组中,LC3呈现点状、聚集性分布,表达强度增加,且具有剂量依赖性；④Western Blot结果显示,与对照组相比,ICJ的处理能够明显上调HUVEC中LC3Ⅱ的表达水平,下调LC3I的表达水平,LC3II/LC3I的比值明显上升(P<0.05,P<0.01)；同时,Beclin-1的表达水平也明显上调；ICJ的作用具有明确的剂量依赖性。对HUVEC细胞凋亡相关的检测结果发现：①Annexin V-FITC/PI双染结果显示,ICJ各个剂量对HUVEC细胞的凋亡率无明显影响。②ICJ各剂量处理对HUVEC中的caspase-3酶活性均无明显影响,与对照组比较,差异无显著性。③ICJ各个剂量处理后,对Western Blot方法检测的HUVEC中凋亡标志性分子Bik蛋白表达亦无明显影响。说明ICJ抑制乳腺癌血管生成的作用及其机制可能与HUVEC细胞的凋亡无关。对HUVEC的自噬和血管生成能力的相关性研究中,可以观察到：①在加入自噬阻断剂Bafilomycin A1之后,HUEVC被ICJ抑制的成管能力得到了部分恢复,细胞出芽率剂量依赖性的升高,与同剂量组相比,具有非常显著的统计学差异(P<0.01)；②在转染Beclin-1的shRNA,干扰HUVEC细胞的Beclin-1的表达,进而抑制自噬之后,与同剂量Mock组相比,HUVEC的细胞出芽率剂量依赖性的升高(P<0.01),成管能力得到恢复。在进一步的机制研究发现：①RT-PCR结果显示,ICJ各个剂量对MDA-MB-231细胞中的VEGFA的mRNA水平无明显影响。② Western Blot结果显示,ICJ可剂量依赖性地下调HUVEC细胞中VEGFR2的表达水平,并且,该作用可被自噬阻断剂Bafilomycin A1消除。③LC3Ⅱ与VEGFR2的免疫共沉淀结果显示,随着ICJ作用剂量的增加,HUVEC细胞LC3Ⅱ与VEGFR2的相互作用明显增强。④ELISA结果显示,在MDA-MB-231和HUVEC的共培养体系上清中,ICJ处理组中的TNF-a水平呈现剂量依赖性的上升,其中2、8μg/mL组与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05及P<0.01)。4结论综合以上实验结果,做出结论如下：(1)ICJ在体内外均可以抑制乳腺癌细胞诱导的血管生成进程；(2)ICJ可诱导乳腺癌微环境中的血管内皮细胞发生非凋亡依赖性的自噬,并通过自噬过程中LC3Ⅱ与VEGFR2的相互作用,降低血管内皮细胞中VEGFR2的水平,阻断血管生成信号的转导,进而抑制乳腺癌的血管生成；(3)ICJ可以诱导乳腺癌微环境中产生诱导血管内皮细胞白噬的可溶性分子,TNF-a和ANGPTL-4可能于此相关。(4)ICJ通过诱导肿瘤微环境中的血管内皮细胞发生白噬进而抑制血管生成的作用具有一定的疾病模型选择性。