胰岛素作为治疗糖尿病的特效必需药，近年来的需求量直线上升。目前，人们常常通过基因工程方法，采用大肠杆菌或酵母表达系统表达人胰岛素前体，然后加工成有活性的人胰岛素。Picha pastoris由于具有表达异源蛋白的较多优点，有望实现人胰岛素前体的高效表达。本研究以Picha pastoris X-33为宿主，以增加人胰岛素前体基因拷贝数、减缓人胰岛素前体降解、高密度发酵工艺初步优化的方法，逐步开展了提高人胰岛素前体产量策略的研究，主要研究结果如下：1首先通过增加目的基因拷贝数的方法，将人源胰岛素前体基因IP与载体pPICZα连接构建表达载体pPICZα-IP，电转至毕赤酵母X-33中，在100μg/mL zeocin的YPDS抗性平板上筛选获得过量表达人胰岛素前体(IP)的重组菌株B4和S6。重组菌株经摇瓶发酵、Tricine-SDS-PAGE和质谱鉴定，证实人源胰岛素前体(IP)实现了诱导表达。然后，以B4和S6为出发菌株，利用SacI线性化的表达载体pPICZα-IP对其分别进行重复电转化，并在1000μg/mL zeocin的YPDS平板上筛选获得一株基因拷贝数为7的重组毕赤酵母2B4。该菌株在5L规模发酵罐上，人源胰岛素前体产量是低基因拷贝数菌株B7的2.7倍，且菌体并未因基因拷贝数高而表现出生长不良的现象。实时定量PCR检测后，发现2B4菌株胰岛素前体基因的转录水平是B7的2倍。综上结果表明，采用抗性筛选和重复电转相结合的高拷贝重组毕赤酵母构建策略，能有效促进目的基因的转录水平，最终显著提高目的蛋白的产量。22B4菌株高密度发酵诱导96h到120h阶段，胰岛素前体产量急速下降。通过体外添加蛋白酶混合抑制剂，发现加入后的上清液较对照组，胰岛素前体的降解得到了有效缓解；而发酵液较对照，胰岛素前体的降解并没有明显缓解，经研究证实，菌体蛋白酶的大量释放导致胰岛素前体产量的下降。通过加入特定蛋白酶抑制剂，发现只有蛋白酶A可以有效缓解发酵液中胰岛素前体的降解。故选用缺失蛋白酶A的宿主酵母SMD1168，制备并筛选出较优重组毕赤酵母HR9。5L发酵罐上，菌株HR9在发酵后期可以缓解胰岛素前体的降解，但因菌体生长速度缓慢，最终未使胰岛素前体的产量有进一步提高。3最后对2B4菌株的高密度发酵工艺进行了研究。将诱导阶段温度分别设定为30°C、25°C、22°C进行高密度培养，发现25°C是生产胰岛素前体的较优温度。诱导72h时，25°C较30°C可使胰岛素前体产量增加11.3%。将诱导阶段的甲醇浓度分别维持在1g/L、2g/L、4g/L，发现2g/L为较佳的甲醇浓度，此甲醇浓度较1g/L，可使胰岛素前体最高产量增加40.0%；另外，甲醇诱导60h添加1%胰蛋白胨，胰岛素前体的最高产量较对照增加14.8%，且96h～120h阶段胰岛素前体的降解率较对照降低了77.5%。