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课题组前期制备pCD86∶RAE-1ε转基因鼠，发现该小鼠脾脏NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞频率显著增多，且分泌TGF-β发挥免疫调节活性。另外，我们初步发现在DSS诱导肠炎小鼠模型中，脾脏中的NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞频率明显增加。为明确DSS诱导小鼠脾脏中增多的NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞是否同pCD86∶RAE-1ε转基因鼠体类似，发挥免疫调节活性，本项目进一步分析DSS肠炎小鼠NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率及其表型变化，以及鉴定该细胞亚群是否在小鼠肠炎中发挥免疫调节活性及其分子机制;并观察NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的体外增殖特性及其在pCD86∶RAE-1ε转基因鼠的组织分布。 研究内容分为两个部分: 第一部分:NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的免疫调节活性鉴定 目的: 鉴定NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的免疫调节活性及其机制。 方法: 首先利用2.5％DSS喂养C57BL/6小鼠，诱导肠炎发生，利用流式细胞术分别检测肠炎小鼠和野生型小鼠肠道和脾脏中CD4+ NKG2D+T细胞的频率;检测肠炎小鼠和野生型小鼠脾脏细胞中CD4+ NKG2D+T细胞中CD3、γδ T以及NK1.1的表达情况;检测NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞TGF-β的表达情况。其次将流式细胞仪分选出的NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞，通过尾静脉过继输入至DSS诱导肠炎小鼠，并且将另一组DSS造模小鼠体内同时输入经TGF-β抗体孵育的NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞，观察小鼠肠炎的发病及体重变化。然后取出小鼠的肠道，肉眼观察小鼠肠道炎症情况;并且将炎性肠道组织制作石蜡切片，利用HE染色，显微镜下观察小鼠肠道的病理改变情况。最后利用基因芯片技术比较NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞和NK1.1+ CD4+ NKG2D+T细胞的转录mRNA和长非编码RNA(LncRNA)的差异表达。 结果: 与野生型小鼠相比，DSS-肠炎诱导小鼠CD4+ NKG2D+T细胞的频率脾脏中增加，肠道中减少;脾脏中增多的CD4+ NKG2D+T细胞中NK1.1-细胞群占主导地位，主要为CD3+ NK1.1-γδ-CD4+ NKG2D+细胞;TGF-β在NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞中高表达;与正常组相比，DSS组、DSS+NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞组、DSS+NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞+TGF-β抗体阻断剂组小鼠都有不同程度的肠炎，而DSS+NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞组小鼠发病情况最轻，体重下降幅度最小，疾病指数最低;并且取出小鼠肠道后，DSS+NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞组的小鼠肠道损伤程度最轻微;经HE染色后，DSS+NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞组的小鼠肠道在显微镜下病理改变也最轻微。而同时输入了经TGF-β抗体孵育的NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞组的小鼠这些现象都有明显的消失。基因芯片的结果发现，在两个样本中，共有161个mRNA基因和741个LncRNA基因发生改变，也从转录RNA水平验证了NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞和NK1.1+ CD4+ NKG2D+T细胞是两群不同的细胞。 结论: DSS-肠炎诱导小鼠增多的CD4+ NKG2D+T细胞主要为NK1.1-细胞群，并且NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞与NK1.1+ CD4+ NKG2D+T细胞是两个不同的细胞亚群;DSS-肠炎诱导小鼠脾脏中增多的NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞是一群调节性T细胞;NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞可以抑制DSS-肠炎诱导小鼠的发病，并且该机制主要是通过产生TGF-β来发挥免疫调节功能的。 第二部分:NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞增殖和其组织分布的特性 目的: 探讨NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的体外增殖特性及其在pCD86∶RAE-1ε转基因鼠体内的分布情况。 方法: 首先利用流式细胞仪分选出NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞;然后用IL-10、TGF-β、IL-6、IL-15单独或者联合sRAE蛋白刺激，分别用MTS/PMS和CFSE法标记，观察NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞增殖和分裂的活性;利用流式细胞术检测pCD86∶RAE-1ε转基因鼠体内脾脏、肠道、肝脏、肺脏、外周血中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率;利用流式细胞术检测NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞表面趋化因子受体CCR9、CCR6、CCR8、CCR4、CCR7的表达。 结果: 与对照组相比，重组sRAE蛋白可以促进NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞增殖。单独IL-6、IL-15能促进NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞增殖，而IL-10、TGF-β、IL-15联合重组sRAE蛋白后也能促进NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的增殖。与野生型对照小鼠相比，NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞在脾脏、肠道、肝脏、外周血中比例明显增加，在肺脏中无明显差异。另外，转基因小鼠体内NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞表面CCR9、CCR8、CCR4表达量增加，而CCR6、CCR7的表达量与野生型对照小鼠相比无明显差异。 结论: 重组sRAE蛋白促进NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞增殖，单独IL-6、IL-15也可促进NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞增殖，并且IL-10、TGF-β、IL-15联合重组sRAE蛋白后可促进NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的增殖。NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞在脾脏、肠道、肝脏、外周血中频率明显增加，提示该细胞群在机体内发挥着免疫调节作用。