【摘 要】
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目前CRISPR/Cas9基因编辑系统在生物学各领域应用广泛,其主要由Cas9蛋白和sg RNA构成。sg RNA/Cas9基因（蛋白）导入细胞的效率是影响该技术应用的重要因素之一。电穿孔转染技术因其具有可操作性强、对细胞毒性作用小等一系列优点,在核酸与蛋白的细胞转染中被广泛应用。但该技术存在高压电场对细胞膜损伤大、细胞死亡率高及转染效率影响因素多的缺点。影响电穿孔转染效率因素包括脉冲电压、脉冲次
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目前CRISPR/Cas9基因编辑系统在生物学各领域应用广泛,其主要由Cas9蛋白和sg RNA构成。sg RNA/Cas9基因（蛋白）导入细胞的效率是影响该技术应用的重要因素之一。电穿孔转染技术因其具有可操作性强、对细胞毒性作用小等一系列优点,在核酸与蛋白的细胞转染中被广泛应用。但该技术存在高压电场对细胞膜损伤大、细胞死亡率高及转染效率影响因素多的缺点。影响电穿孔转染效率因素包括脉冲电压、脉冲次数、脉冲时长、电转缓冲液与外源基因浓度等,因此研究中对影响因素进行优化变得至关重要。本研究的目的是基于BEX电转仪、以猪MSTN基因为靶点,在猪PK-15细胞系中摸索各转染条件,以期建立稳定高效的Cas9质粒与RNP（核糖核蛋白）复合物转染体系。通过摸索脉冲电压、脉冲次数、脉冲时长、电转缓冲液、质粒与RNP复合物浓度等条件,分析转染后细胞的贴壁率、荧光阳性率与基因组编辑效率,从而确定最佳的转染体系。结果如下:（1）PK-15细胞电穿孔转染MSTN的sg RNA/Cas9质粒结果表明,150V脉冲电压、1次脉冲次数、15 ms脉冲时长、OPTI-MEM作为电转缓冲液、质粒浓度2μg Cas9-e GFP和4μg sg RNA时,PK-15细胞贴壁率较高,转染效率可达20.05%。（2）PK-15细胞电穿孔转染RNP复合物结果表明:200V脉冲电压、1次脉冲次数、10ms脉冲时长、OPTI-MEM作为电转缓冲液、RNP复合物浓度30 pmol Cas9蛋白和60 pmol sg RNA时,PK-15细胞贴壁率较高,转染效率可达51%。综上,本研究在PK-15细胞系上基于BEX电转仪建立了稳定的Cas9质粒与RNP复合物转染体系。
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